膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性快速測(cè)定法診斷臂叢損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]臂叢損傷是臨床上常見的損傷，致殘嚴(yán)重。臂叢根性損傷可分為節(jié)前損傷和節(jié)后損傷。節(jié)前損傷即臂叢神經(jīng)根性撕脫傷，神經(jīng)根在脊髓部位的絲狀結(jié)構(gòu)斷裂，由于絲狀結(jié)構(gòu)斷裂后在脊髓表面無殘根可供縫接修復(fù)，且損壞脊神經(jīng)根較長(zhǎng)，可供移位修復(fù)的神經(jīng)在數(shù)量和質(zhì)量上均難以滿足臂叢神經(jīng)修復(fù)的需要，對(duì)手臂功能損害尤為嚴(yán)重。不同損傷類型治療方法不同：節(jié)后損傷可行神經(jīng)吻合或神經(jīng)移植治療；而節(jié)前損傷確診后應(yīng)及早進(jìn)行神經(jīng)移位手術(shù)。因此臂叢神經(jīng)節(jié)前與節(jié)后損傷的準(zhǔn)確判定，

2、對(duì)手術(shù)方式的選擇具有重要意義。對(duì)于椎孔外臂叢神經(jīng)損傷可通過手術(shù)探查確診，但椎管內(nèi)神經(jīng)的絲狀結(jié)構(gòu)是否斷裂很難通過探查術(shù)來判定，除非行椎管內(nèi)探查術(shù)。盡管椎管造影后CT(CTM)、B超、MRI、神經(jīng)電生理等方法都能在一定程度上診斷臂叢損傷，但各有一定的局限性。所以尋找同樣準(zhǔn)確，但更快速，可用于術(shù)中快速判斷臂叢損傷類型的診斷方法是臂叢損傷診斷治療整個(gè)研究課題中的重要內(nèi)容。本研究使用放射性同位素的方法快速(50min-1h)測(cè)定神經(jīng)殘端膽堿乙?；?/p>

3、轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性，以期在探查手術(shù)時(shí)對(duì)神經(jīng)殘端的損傷類型作出判斷，指導(dǎo)手術(shù)方法的選擇。 [方法]1.動(dòng)物選擇與分組選用健康成年雌性SD大鼠45只，體重260～300g，編號(hào)、標(biāo)記，將其中的42只隨機(jī)選一側(cè)臂叢C6神經(jīng)根造成節(jié)前損傷，另一側(cè)造成節(jié)后損傷，分別為節(jié)前損傷組和節(jié)后損傷組。損傷后分別于1d、3d、5d、7d、15d、30d及90d取材，每次取6只。另有3只作為正常無損傷對(duì)照組。即節(jié)前損傷共42個(gè)神經(jīng)根，節(jié)后損傷共42

4、個(gè)神經(jīng)根。正常無損傷對(duì)照的C6神經(jīng)根6個(gè)。 2.試劑及儀器乙二胺四乙酸、14C標(biāo)記的乙酰輔酶A、氯化膽堿、硫酸毒扁豆堿、四苯基硼、二異丁基酮溶液、手術(shù)顯微鏡、顯微手術(shù)器械、臺(tái)式高速離心機(jī)、微量移液槍、電子天平、低溫冰箱、恒溫孵育箱、液體閃爍計(jì)數(shù)器。 3.大鼠臂叢損傷動(dòng)物模型的制作3.1節(jié)前損傷(根性撕脫傷)雌性SD大鼠，體重260～300g，以水合氯醛腹腔注射麻醉(30mg/kg)，麻醉生效后，仰臥位，四肢牽向兩側(cè)固定于

5、固定板，頸部及前肢備皮，常規(guī)碘酒消毒、鋪巾。以下操作均在10倍手術(shù)顯微鏡下完成。 頸部前正中切口，由下頜至胸鎖關(guān)節(jié)，長(zhǎng)約4cm。切開皮膚、皮下組織。將胸骨乳突肌、鎖斜方肌連同鎖骨向下外側(cè)牽開，向外側(cè)牽開并保護(hù)頸總動(dòng)脈，銳性切斷胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌，將頭直肌、頸長(zhǎng)肌連同頸總動(dòng)脈、迷走神經(jīng)及氣管向?qū)?cè)牽開，充分暴露斜角肌并銳性切斷。顯露并確認(rèn)C6神經(jīng)根，顯露C6神經(jīng)根處及C5、C6椎體腹側(cè)的右半部，清除其上附著的肌肉和韌帶用自制尖

6、頭咬骨鉗(持針器前端磨尖制成)咬除相應(yīng)頸椎C5/6部分橫突根部及部分椎弓根，以擴(kuò)大C5/6椎間孔(注意保護(hù)椎動(dòng)脈)，使其大于脊神經(jīng)節(jié)橫徑。充分游離神經(jīng)根，用顯微剪剪除神經(jīng)根周圍的結(jié)締組織，用神經(jīng)拉鉤緊貼椎孔，向頭側(cè)略用力緩緩牽拉C6神經(jīng)根，至神經(jīng)節(jié)脫出椎間孔為止，此時(shí)可見前根和后根的辮狀結(jié)構(gòu)，逐層縫合，關(guān)閉切口。 3.2節(jié)后損傷同上手術(shù)入路顯露并確認(rèn)C6神經(jīng)根，在靠近椎間孔處造成C6損傷(切斷)。 4.ChAT活性的測(cè)定

7、重新按照頸前方手術(shù)入路的方法暴露臂叢神經(jīng)，找到并分離出C6神經(jīng)根斷端。切取1.5mm神經(jīng)作為標(biāo)本。 標(biāo)本勻漿，放入到含20μl緩沖液A(PH7.4的50mmol/L磷酸鈉緩沖液，300mmol/L氯化鈉，20mmol/LEDTA)的離心管內(nèi)。20μl混合孵育液(0.0476μCi[1-14C]acetylCo-A，18.8μl已加入標(biāo)本的緩沖液A，0.2μl1.6mmol/L氯化膽堿，lμl5mmol/L硫酸毒扁豆堿)配成后在3

8、7℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束時(shí)加入15mg/ml的四苯基硼的二異丁基酮溶液100μl。離心(20000g)1次，2分鐘。取40μl上清液(有機(jī)相)移入閃爍杯，加入10ml甲苯閃爍液。輕搖1min，，靜置10分鐘。 用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量14C的放射活性，即可表示ChAT活性。結(jié)果以每分鐘計(jì)數(shù)(counterperminute，cpm)表示。 5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析計(jì)量資料采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，

9、P值＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 [結(jié)果]1)大鼠正常臂叢神經(jīng)根ChAT的活性平均為(7702±1503)cpm。 2)節(jié)前損傷組，ChAT的活性1d、3d、5d、7d、15d、30d、91d后為依次為(5928±1458)cpm、(2783±808)cpm、(1021±324)cpm、(675±258)cpm、(554±213)cpm、(354±137)cpm、(328±143)cp

10、m。從1d開始隨時(shí)間降低較快，7d時(shí)降低到(675±258)cpm(約為正常的1/10)，之后ChAT活性變化較小，90d時(shí)為(328±143)cpm。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明1d組與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值＞0.05)，3d與1d、5d與3d有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值＜0.05)。5d之后維持在相對(duì)較低的水平。 3)在節(jié)后損傷組，ChAT的活性1d、3d、5d、7d、15d、30d、91d后為依次為(7541±1191)cpm、(6994

11、±1405)cpm、(6816±1621)cpm、(6988±1524)cpm、(5884±907)cpm、(5144±1126)cpm、(4906±1119)cpm。ChAT活性在前7d基本不變，各組數(shù)據(jù)與正常組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，15d稍低為(5884±907)cpm，15d以后均與正常組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，30d(5144±1126)cpm與90d(4906±1119)cpm相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4)同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)節(jié)后與節(jié)前之間

12、ChAT的活性橫向比較，在1d、3d組，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在5d、7d、15d、30d、90d組，都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，節(jié)后活性明顯高于節(jié)前。 [結(jié)論]1.大鼠臂叢節(jié)前和節(jié)后損傷后，神經(jīng)斷端ChAT的活性隨時(shí)間降低的速度不同，從5d后有顯著差異，可以從用來區(qū)分臂叢節(jié)前節(jié)后損傷。 2.測(cè)定神經(jīng)斷端ChAT的活性可以用來定量地判定臂叢損傷后的神經(jīng)殘端的運(yùn)動(dòng)功能，反映神經(jīng)殘端的可修復(fù)性，是否可以作為修復(fù)神經(jīng)缺損的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)修復(fù)源。