膽堿乙?；D移酶活性快速測定法診斷臂叢損傷的實驗研究.pdf

1、[目的]臂叢損傷是臨床上常見的損傷，致殘嚴重。臂叢根性損傷可分為節(jié)前損傷和節(jié)后損傷。節(jié)前損傷即臂叢神經根性撕脫傷，神經根在脊髓部位的絲狀結構斷裂，由于絲狀結構斷裂后在脊髓表面無殘根可供縫接修復，且損壞脊神經根較長，可供移位修復的神經在數(shù)量和質量上均難以滿足臂叢神經修復的需要，對手臂功能損害尤為嚴重。不同損傷類型治療方法不同：節(jié)后損傷可行神經吻合或神經移植治療；而節(jié)前損傷確診后應及早進行神經移位手術。因此臂叢神經節(jié)前與節(jié)后損傷的準確判定，

2、對手術方式的選擇具有重要意義。對于椎孔外臂叢神經損傷可通過手術探查確診，但椎管內神經的絲狀結構是否斷裂很難通過探查術來判定，除非行椎管內探查術。盡管椎管造影后CT(CTM)、B超、MRI、神經電生理等方法都能在一定程度上診斷臂叢損傷，但各有一定的局限性。所以尋找同樣準確，但更快速，可用于術中快速判斷臂叢損傷類型的診斷方法是臂叢損傷診斷治療整個研究課題中的重要內容。本研究使用放射性同位素的方法快速(50min-1h)測定神經殘端膽堿乙酰基

3、轉移酶(ChAT)活性，以期在探查手術時對神經殘端的損傷類型作出判斷，指導手術方法的選擇。 [方法]1.動物選擇與分組選用健康成年雌性SD大鼠45只，體重260～300g，編號、標記，將其中的42只隨機選一側臂叢C6神經根造成節(jié)前損傷，另一側造成節(jié)后損傷，分別為節(jié)前損傷組和節(jié)后損傷組。損傷后分別于1d、3d、5d、7d、15d、30d及90d取材，每次取6只。另有3只作為正常無損傷對照組。即節(jié)前損傷共42個神經根，節(jié)后損傷共42

4、個神經根。正常無損傷對照的C6神經根6個。 2.試劑及儀器乙二胺四乙酸、14C標記的乙酰輔酶A、氯化膽堿、硫酸毒扁豆堿、四苯基硼、二異丁基酮溶液、手術顯微鏡、顯微手術器械、臺式高速離心機、微量移液槍、電子天平、低溫冰箱、恒溫孵育箱、液體閃爍計數(shù)器。 3.大鼠臂叢損傷動物模型的制作3.1節(jié)前損傷(根性撕脫傷)雌性SD大鼠，體重260～300g，以水合氯醛腹腔注射麻醉(30mg/kg)，麻醉生效后，仰臥位，四肢牽向兩側固定于

5、固定板，頸部及前肢備皮，常規(guī)碘酒消毒、鋪巾。以下操作均在10倍手術顯微鏡下完成。 頸部前正中切口，由下頜至胸鎖關節(jié)，長約4cm。切開皮膚、皮下組織。將胸骨乳突肌、鎖斜方肌連同鎖骨向下外側牽開，向外側牽開并保護頸總動脈，銳性切斷胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌，將頭直肌、頸長肌連同頸總動脈、迷走神經及氣管向對側牽開，充分暴露斜角肌并銳性切斷。顯露并確認C6神經根，顯露C6神經根處及C5、C6椎體腹側的右半部，清除其上附著的肌肉和韌帶用自制尖

6、頭咬骨鉗(持針器前端磨尖制成)咬除相應頸椎C5/6部分橫突根部及部分椎弓根，以擴大C5/6椎間孔(注意保護椎動脈)，使其大于脊神經節(jié)橫徑。充分游離神經根，用顯微剪剪除神經根周圍的結締組織，用神經拉鉤緊貼椎孔，向頭側略用力緩緩牽拉C6神經根，至神經節(jié)脫出椎間孔為止，此時可見前根和后根的辮狀結構，逐層縫合，關閉切口。 3.2節(jié)后損傷同上手術入路顯露并確認C6神經根，在靠近椎間孔處造成C6損傷(切斷)。 4.ChAT活性的測定

7、重新按照頸前方手術入路的方法暴露臂叢神經，找到并分離出C6神經根斷端。切取1.5mm神經作為標本。 標本勻漿，放入到含20μl緩沖液A(PH7.4的50mmol/L磷酸鈉緩沖液，300mmol/L氯化鈉，20mmol/LEDTA)的離心管內。20μl混合孵育液(0.0476μCi[1-14C]acetylCo-A，18.8μl已加入標本的緩沖液A，0.2μl1.6mmol/L氯化膽堿，lμl5mmol/L硫酸毒扁豆堿)配成后在3

8、7℃下孵育30分鐘。孵育結束時加入15mg/ml的四苯基硼的二異丁基酮溶液100μl。離心(20000g)1次，2分鐘。取40μl上清液(有機相)移入閃爍杯，加入10ml甲苯閃爍液。輕搖1min，，靜置10分鐘。 用液體閃爍計數(shù)器測量14C的放射活性，即可表示ChAT活性。結果以每分鐘計數(shù)(counterperminute，cpm)表示。 5.數(shù)據統(tǒng)計與分析計量資料采用均數(shù)士標準差表示，多組間數(shù)據比較采用單因素方差分析，

9、P值＜0.05有統(tǒng)計學意義。數(shù)據運用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計。 [結果]1)大鼠正常臂叢神經根ChAT的活性平均為(7702±1503)cpm。 2)節(jié)前損傷組，ChAT的活性1d、3d、5d、7d、15d、30d、91d后為依次為(5928±1458)cpm、(2783±808)cpm、(1021±324)cpm、(675±258)cpm、(554±213)cpm、(354±137)cpm、(328±143)cp

10、m。從1d開始隨時間降低較快，7d時降低到(675±258)cpm(約為正常的1/10)，之后ChAT活性變化較小，90d時為(328±143)cpm。數(shù)據經統(tǒng)計學分析表明1d組與正常組無統(tǒng)計學差異(P值＞0.05)，3d與1d、5d與3d有統(tǒng)計學差異(P值＜0.05)。5d之后維持在相對較低的水平。 3)在節(jié)后損傷組，ChAT的活性1d、3d、5d、7d、15d、30d、91d后為依次為(7541±1191)cpm、(6994

11、±1405)cpm、(6816±1621)cpm、(6988±1524)cpm、(5884±907)cpm、(5144±1126)cpm、(4906±1119)cpm。ChAT活性在前7d基本不變，各組數(shù)據與正常組之間均無統(tǒng)計學差異，15d稍低為(5884±907)cpm，15d以后均與正常組之間有統(tǒng)計學差異，30d(5144±1126)cpm與90d(4906±1119)cpm相比無統(tǒng)計學差異。 4)同一時間點時節(jié)后與節(jié)前之間

12、ChAT的活性橫向比較，在1d、3d組，無統(tǒng)計學差異；在5d、7d、15d、30d、90d組，都有統(tǒng)計學差異，節(jié)后活性明顯高于節(jié)前。 [結論]1.大鼠臂叢節(jié)前和節(jié)后損傷后，神經斷端ChAT的活性隨時間降低的速度不同，從5d后有顯著差異，可以從用來區(qū)分臂叢節(jié)前節(jié)后損傷。 2.測定神經斷端ChAT的活性可以用來定量地判定臂叢損傷后的神經殘端的運動功能，反映神經殘端的可修復性，是否可以作為修復神經缺損的運動神經修復源。