不溶活性ELPs-木聚糖酶聚集體特性及其間歇反應(yīng)器中動力學(xué)研究.pdf

1、本課題設(shè)計了一種新型類彈性蛋白多肽ELPs(即ELP[KV8F-20])純化標(biāo)簽,在可逆熱循環(huán)(Inverse thermal cycling,ITC)純化ELPs-木聚糖酶酶過程中發(fā)現(xiàn)很大一部分ELPs-木聚糖酶重組蛋白(約為75％)相變過程不可逆,即溫度低于相變溫度時,相變后的ELPs-木聚糖酶重組蛋白不可溶,測的其酶活力占總酶活力的92%,活力很高,類似于木聚糖酶被固定在相變的ELPs聚集體上,因而具有重要的研究意義。
　　

2、首先,考察了不溶活性ELPs-木聚糖酶聚集體(Insoluble active ELPs-xylanase aggregrates,IAEXA)的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明IAEXA的最適反應(yīng)pH為6.0,與自由酶的最適反應(yīng)pH相同,但是其最適pH范圍是5~7,而自由木聚糖酶為6~7。自由木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃,而IAEXA升高至70℃。自由木聚糖酶和IAEXA的Km分別為0.374 g·L-1和0.980 g·L-1,說明與自由酶相比

3、,IAEXA與底物的親和力降低,但是其pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性有了巨大提高。這種具有較高酶活力和穩(wěn)定性的不溶木聚糖酶顆?？梢宰鳛楣潭ɑ笐?yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
　　其次,把 IAEXA作為固定化酶,考察了其間歇酶反應(yīng)器中的動力學(xué)性質(zhì),并對整個過程進行了優(yōu)化。結(jié)果獲得動力學(xué)常數(shù)Km=2.50 g·L-1,Vmax=2.64×10-4 mol·L-1·min-1,最大反應(yīng)速率常數(shù) K+2=0.475 min-1;水解反應(yīng)不存在底物抑

4、制現(xiàn)象,而存在產(chǎn)物抑制現(xiàn)象,產(chǎn)物抑制常數(shù)Kp=0.09 g·L-1;對整個過程優(yōu)化后得到:對每一個確定的DH,目標(biāo)函數(shù)的取值僅與酶濃度和初始底物濃度有關(guān),理論上酶用量越高越好,但在實際生產(chǎn)中,需要綜合考慮加酶成本和水解時間內(nèi)的操作成本兩項內(nèi)容,從而優(yōu)化出最適加酶量。同時通過不同水解度下 h(S0)對 S0曲線圖可獲得最優(yōu)底物濃度。
　　最后,考察了 IAEXA在不同鹽和緩沖液條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果表明該聚集體在不同鹽和緩沖液條件下均

5、比較穩(wěn)定,活力保持在78.01~97.32%。其中經(jīng)過0.8 mol·L-1 Na2CO3相變后獲得的IAEXA在醋酸-醋酸鹽緩沖液中穩(wěn)定性最好,不溶部分酶活力占97.32%。然后對IAEXA進行了超聲波及超高壓勻質(zhì)處理,結(jié)果顯示IAEXA幾乎都轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇軤顟B(tài)。其中1000 bar高壓勻質(zhì)處理的體系最穩(wěn)定,粒徑最小。紅外光譜分析表明IAEXA中含有有β-折疊、無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu),說明ELPs與木聚糖酶之間的次級鍵作用(如氫鍵、鹽鍵