堿性木聚糖酶基因在大腸桿菌中的表達及重組木聚糖酶的特性.pdf

1、植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)組成。木聚糖是植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素外最為豐富的多糖，也是自然界中主要的可再生資源。由于結(jié)構(gòu)復雜，它的完全降解需要多種酶的參與，其中內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶（簡稱木聚糖酶，EC3.2.1.8）是最重要的一種。 本論文以堿性木聚糖酶基因為研究對象，主要進行了以下幾方面的研究工作： 1.堿性木聚糖酶基因xylA的擴增； 2.xylA基因表達載體的構(gòu)建

2、； 3.xylA基因在大腸桿菌中的表達； 4.重組木聚糖酶酶學性質(zhì)和應用特性的研究。 本論文主要研究結(jié)果和結(jié)論如下： 1、以含堿性木聚糖酶基因的pCT124為模板，利用自行設(shè)計的引物1和引物2，進行常規(guī)的PCR擴增反應，成功擴增出堿性木聚糖酶xylA基因?；蛐蛄信c文獻報道的一致，該耐堿性木聚糖酶屬于G/10族。 2、PCR擴增的堿性木聚糖酶基因（xylA）通過EcoRⅠ和XholⅠ位點，以正確的

3、ORF與原核表達載體pGEX-4T-1上的α-因子信號肽編碼序列3'端融合，構(gòu)建成重組表達載體pGEX-xylA。進行PCR菌落鑒定和雙酶切鑒定，確定堿性木聚糖酶在大腸桿菌中成功的進行了表達。測定胞外、胞內(nèi)和周質(zhì)空間的木聚糖酶分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有周質(zhì)空間表達產(chǎn)物具有生物學活性，可溶。這說明該木聚糖酶的信號肽能夠被大腸桿菌信號系統(tǒng)識別。 3、木聚糖酶的pI值為5.0，分子量約為40.0kDa，與理論推算的分子量（39.1kDa）相吻

4、合。該酶的最適作用溫度為40℃，在25-50℃的溫度范圍內(nèi)，酶活性變化不大（相對酶活>50％），具有較高的耐熱性；木聚糖酶的最適作用pH為8.0，穩(wěn)定pH范圍在6.0-11.0之間，堿穩(wěn)定性較強，適合用于紙漿造紙工業(yè)。 4、重組菌株木聚糖酶性質(zhì)研究 Mg2+、Fe2+、K+、Ca2+對木聚糖酶活性有不同程度的促進作用，可能是影響了酶與底物的結(jié)合及解離狀態(tài)；Hg2+、Ag+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、I2等對木聚糖酶

5、有顯著的抑制作用，而Co2+、Na+、Ni2+、Zn2+、I-、Cl-等對木聚糖酶的活性沒有明顯的作用，這與細菌來源的木聚糖酶性質(zhì)一致。EDTA對酶活力沒有顯著的影響，僅降低了2％的相對酶活力，這說明木聚糖酶反應不需要金屬離子的參與，有利于在工業(yè)上的實際應用。5mmol/L的SDS幾乎使木聚糖酶完全失活，這可能是由于木聚糖酶分子中缺乏二硫橋結(jié)構(gòu)的緣故。因為，相對而言，通常沒有二硫橋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子在變性劑存在下或受熱時更容易變性失活。