重組菌BL21-HTA-cgkZ產(chǎn)κ-卡拉膠酶的發(fā)酵優(yōu)化及分離純化.pdf

1、卡拉膠是從麒麟菜、角叉菜和沙菜等紅藻細(xì)胞壁中提取的含有硫酸基的線性多糖的統(tǒng)稱，主要有κ-卡拉膠、ι-卡拉膠和λ-卡拉膠三種類型。近年來，對(duì)寡糖結(jié)構(gòu)和活性的深入研究發(fā)現(xiàn)，κ-卡拉膠寡糖及它的一些衍生物具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等重要的生理活性，而且κ-卡拉膠寡糖相較于卡拉膠而言，其分子量更小、溶解性好、更易吸收，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出較大的開發(fā)價(jià)值和較好的應(yīng)用前景。κ-卡拉膠酶是一種作用于κ-卡拉膠的多糖水解酶，可以斷裂κ-卡拉膠的β-1，

2、4糖苷鍵獲得κ-卡拉膠寡糖，而且具有手段溫和、操作簡便和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的獲得κ-卡拉膠寡糖的手段。
　　本論文在實(shí)驗(yàn)室利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建出能夠胞外表達(dá)κ-卡拉膠酶的重組菌BL21-HTa-cgkZ的基礎(chǔ)上，對(duì)重組菌BL21-HTa-cgkZ進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化、酶的分離純化及酶制劑的制備工藝等方面的研究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)在IPTG誘導(dǎo)下的κ（-卡拉膠酶的產(chǎn)生菌

3、BL21-HTa-cgkZ進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化。通過單因子篩選實(shí)驗(yàn)確定了重組菌BL21-HTa-cgkZ產(chǎn)卡拉膠酶的最佳培養(yǎng)基組成為:乳糖7g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10 g/L，CaCl20.666 g/L。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析獲得重組菌BL21-HTa-cgkZ產(chǎn)κ-卡拉膠酶的最佳誘導(dǎo)條件為:在重組菌接種1.55 h后添加IPTG，IPTG的濃度為0.89 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為24 h，

4、誘導(dǎo)溫度為23℃。在最佳培養(yǎng)基組成和最適誘導(dǎo)條件下發(fā)酵24 h，胞外酶活力可以達(dá)到10.76 U/mL，而野生型κ-卡拉膠酶產(chǎn)生菌Zobellia sp.ZM-2的酶活力為0.33 U/mL，是Zobellia sp.ZM-2產(chǎn)酶能力的32.6倍。并研究了在培養(yǎng)基中添加乳糖、TritonⅩ-100和Tween-80對(duì)κ-卡拉膠酶分布的影響。結(jié)果表明，乳糖增加酶活力的方式與TritonⅩ-100和Tween-80增加酶活力方式是不同的。乳

5、糖是通過促進(jìn)菌體生長以利于總酶量的提高，而TritonⅩ-100和Tween-80是通過改變細(xì)胞膜的通透性促進(jìn)胞內(nèi)酶向胞外的釋放。
　　2.對(duì)重組菌BL21-HTa-cgkZ發(fā)酵產(chǎn)生的κ-卡拉膠酶進(jìn)行分離純化及鑒定。粗酶液經(jīng)過CM Sepharose Fast Flow離子交換層析、超濾濃縮和Sephadex G-75凝膠過濾層析后，聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得一條十分清晰的條帶，該條帶分子量大小為62 kDa，與根據(jù)κ-卡拉膠酶基因c

6、gkZ推測出的蛋白質(zhì)分子量大小一致。將這個(gè)條帶寄送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心，以κ-卡拉膠酶基因cgkZ編碼的蛋白質(zhì)序列建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，經(jīng)LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定可以確定該條帶即為含有κ-卡拉膠酶蛋白的條帶。經(jīng)過分離純化，κ-卡拉膠酶的純化倍數(shù)為12.33倍，比活力為94.23 U/mg。在確定了重組蛋白κ-卡拉膠酶的分子量后，以此為依據(jù)，對(duì)重組菌BL21-HTa-cgkZ產(chǎn)生的κ-卡拉膠酶的表達(dá)形式進(jìn)行了研究，確定了κ-卡拉膠酶

7、并未以包涵體的形式表達(dá)。
　　3.κ-卡拉膠酶酶制劑的初步制備。對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，得到的卡拉膠酶的酶活力為10.82 U/mL，與搖瓶發(fā)酵水平相當(dāng)。對(duì)獲得的κ-卡拉膠酶粗酶液分別進(jìn)行硫酸銨沉淀、乙醇沉淀和丙酮沉淀提取κ-卡拉膠酶。結(jié)果顯示，硫酸銨沉淀和丙酮沉淀對(duì)κ-卡拉膠酶的酶活力損失都非常大，而乙醇沉淀是一種比較溫和的提取κ-卡拉膠酶的方法。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)乙醇沉淀的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到影響乙醇沉