三種重組肝素酶的表達(dá)條件優(yōu)化及分離純化.pdf

1、本文在大腸桿菌中重組表達(dá)三種肝素酶，在搖瓶中通過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化提高目標(biāo)蛋白的可溶表達(dá)量，進(jìn)一步于5L發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上利用Ni離子親和層析純化蛋白，最后對(duì)蛋白的活性進(jìn)行了測(cè)定。
　　首先，優(yōu)化肝素酶Ⅰ在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pOFX-T7-SL1中的重組表達(dá)條件，結(jié)果顯示在MBL培養(yǎng)基中，接種6h(OD600≈2.5)后加入0.25mMIPTG，在25℃下表達(dá)8h目標(biāo)蛋白酶活達(dá)到最高值1.49×105

2、IU/L。進(jìn)一步于5L發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，20h后最高酶活達(dá)到5.55×105 IU/L。利用親和層析分離目標(biāo)蛋白，肝素酶Ⅰ的純度可達(dá)到96％，回收率為37.58％，比酶活達(dá)到1.12×103IU/mg。
　　其次，優(yōu)化肝素酶Ⅱ在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中的重組表達(dá)條件，結(jié)果顯示在MBL培養(yǎng)基中，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期(OD600≈2.5)后加入0.5mMIPTG，在25℃下表達(dá)6h目標(biāo)蛋白酶活達(dá)到最高值8.70×103I

3、U/L。進(jìn)一步于5L發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，18h后最高酶活達(dá)到2.35×104 IU/L。利用親和層析分離目標(biāo)蛋白，肝素酶Ⅱ的純度可達(dá)到90％，回收率為47％，比酶活達(dá)到196IU/mg。
　　最后，優(yōu)化肝素酶Ⅲ在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中的重組表達(dá)條件，結(jié)果顯示在MBL培養(yǎng)基中，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期(OD600≈2.5)后加入0.1mMIPTG，在20℃下表達(dá)6h目標(biāo)蛋白酶活達(dá)到最高值4.02×103 IU/L。利用親和