TLR4通過增強TGF-β-Smad信號通路介導前列腺增生上皮細胞EMT的機制研究.pdf

1、[研究背景]
　　良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是老年男性的常見和多發(fā)性疾病。隨著人們生活水平的提高和人均壽命的延長，其發(fā)病率正逐年上升。年齡的增長和有功能睪丸的存在是BPH發(fā)病的必要條件，但其發(fā)病機制尚不明確。近年來，前列腺炎癥在BPH發(fā)病機制中的重要作用已引起了眾多關注，有學者提出BPH是一種免疫介導的炎性疾病。
　　Toll樣受體4(Toll like recepto

2、rs4，TLR4)是LPS的受體，在機體應對病原微生物的先天性免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用。TLR4不僅在各種免疫細胞上表達，還在各種上皮和內皮細胞大量表達，作為機體先天性免疫的第一道防線。有文獻報道，TLR4信號可能參與前列腺上皮細胞EMT的發(fā)生，從而促進前列腺疾病的發(fā)生和進展。
　　轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β，TGF-β1)是一種多效性細胞因子，參與細胞重構過程，如細胞增殖、凋亡、分

3、化及遷移。骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BMP and activin membrane-boundinhibitor, BAMBI)，作為TGF-β信號通路偽受體，可以與TGF-βⅠ型受體競爭，阻止Ⅰ型與Ⅱ型受體及配體結合成功能性復合物，從而阻斷TGF-β信號的傳遞。關于BAMBI蛋白在人體各組織的表達已有文獻報道。然而，關于BAMBI蛋白在人體前列腺增生組織中的具體表達情況卻很少有文獻報道。
　　上皮-間質轉化(Epithe

4、lial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞失去極性，表現(xiàn)出遷移能力增強，在細胞基質間能夠自由移動且呈現(xiàn)間質細胞表型的轉化過程。研究發(fā)現(xiàn)，在BPH組織，部分上皮細胞失去E-cadherin蛋白表達，同時獲得Vimentin蛋白表達，提示BPH發(fā)生發(fā)展過程中間質細胞的積累可能來源于前列腺上皮細胞。TGF-β1被認為是誘導上皮細胞發(fā)生EMT的關鍵因子，盡管TGF-β信號通路相對較簡單，但其調節(jié)機制卻十分復雜。

5、目前，TGF-β信號通路的調控及其與其他信號通路的關系已成為一個新的研究熱點。
　　為了探討LPS/TLR4、BAMBI及TGF-β/Smad信號通路在前列腺增生EMT過程中的信號轉導及相互作用機制，我們首先運用免疫組化及免疫熒光雙染技術檢測了TLR4、BAMBI、p-Smad2/3在BPH組織中的表達及共定位。然后運用實時定量PCR、Western-blot及免疫組化技術檢測了LPS及TGF-β1刺激后BPH-1細胞EMT各項指

6、標的表達情況，研究TLR4增強TGF-β-EMT信號通路的作用。最后運用腺病毒轉染技術構建BAMBI高表達及低表達的BPH-1細胞系，探討TLR4通過下調BAMBI增強TGF-β/Smad-EMT信號通路的作用機制，為BPH的發(fā)病機制提供新的思路。
　　[方法與結果]
　　1.TLR4、p-Smad2/3在合并炎癥的BPH組織中表達水平顯著上調:采用免疫組化檢測62例BPH組織中TLR4、BAMBI及p-Smad2/3的表達

7、，結果發(fā)現(xiàn)在合并炎癥的47例BPH組織中TLR4及p-Smad2/3的表達顯著高于未合并炎癥的15例BPH組織，而BAMBI在合并炎癥及未合并炎癥的BPH組織中表達無顯著性差異(p＜0.05)。
　　2.在合并炎癥的BPH組織中，TLR4與BAMBI表達呈負相關，與p-Smad2/3表達呈正相關:采用Spearman相關分析研究TLR4、BAMBI及p-Smad2/3在BPH組織中表達的相關性。結果發(fā)現(xiàn)，在單純BPH中，TLR4與

8、BAMBI、p-Smad2/3表達均無直線相關(r=-0.152、0.099，P=0.108、0.240)，BAMBI與p-Smad2/3蛋白表達呈弱的負相關(r=-0.298，P=0.041)。在合并炎癥的BPH中，TLR4與BAMBI表達呈負相關(r=-0.533，P=0.007)，TLR4與p-Smad2/3表達呈正相關(r=0.308，P=0.015)，BAMBI與p-Smad2/3表達呈負相關(r=-0.612，P=0.004

9、)。
　　3.TLR4與BAMBI、TLR4與p-Smad2/3在BPH組織中共表達:采用免疫熒光雙染的細胞共定位技術檢測BPH組織中TLR4與BAMBI、TLR4與p-Smad2/3的同步表達和定位。結果發(fā)現(xiàn)，在BPH組織中，特別是BPH上皮細胞中可以觀察到TLR4與BAMBI、TLR4與p-Smad2/3的同步表達和定位。
　　4.LPS/TLR4通過增強TGF-β/Smad信號通路誘導BPH-1細胞發(fā)生EMT:選取BP

10、H-1細胞株作為研究對象，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)BPH-1細胞表達TLR4及BAMBI，且在LPS刺激后TLR4表達上調、BAMBI表達下調，但p-Smad2/3表達陰性。采用實時定量PCR、Western blot及免疫組化檢測各組EMT通路下游指標的表達，結果顯示，10ug/ml LPS+0.1 ng/ml TGF-β1作用組E-cadherin的mRNA及蛋白表達顯著低于空白對照及陰性對照組(P＜0.05)，Vimentin及p-Sma

11、d2/3的mRNA及蛋白表達顯著高于空白對照及陰性對照組(P＜0.05)。加入TLR4阻斷劑CLI-095后，10ug/ml LPS+0.1ng/mlTGF-β1下調E-cadherin及上調Vimentin、p-Smad2/3的作用被抑制(P＜0.05)。
　　5.LPS/TLR4信號下調BPH-1細胞BAMBI的表達:運用實時定量PCR、Western Blot及免疫組化染色的方法檢測LPS刺激后BPH-1細胞BAMBI蛋白的

12、表達變化。結果發(fā)現(xiàn)，LPS作用組BAMBI的mRNA及蛋白表達含量顯著低于空白對照組及LPS+CLI-095共同作用組(P＜0.05)。
　　6.TLR4通過下調BAMBI增強TGF-β/Smad-EMT信號通路:采用腺病毒轉染技術，構建了BAMBI蛋白低表達(AddnBambi)與過表達(AdBambi)的BPH-1細胞系，以未轉染BPH-1細胞作為空白對照。采用實時定量PCR、Western blot及免疫組化檢測各組EMT通

13、路下游指標的表達。結果顯示，在10ug/ml LPS+0.1ng/ml TGF-β1作用后，AdBambi組的p-Smad2/3及Vimentin表達顯著低于空白對照組，E-cadherin表達顯著高于空白對照組(P＜0.05)，而AddnBambi組的p-Smad2/3、E-cadherin及Vimentin表達與空白對照組無顯著性差異(P＞0.05）。
　　[結論]
　　1.在合并炎癥的BPH組織，TLR4及p-Smad

14、2/3的表達顯著上調，提示TLR4及TGF-β/Smad信號通路可能參與炎癥促進BPH的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　2.在合并炎癥的BPH組織中，TLR4與BAMBI表達呈負相關，與p-Smad2/3表達呈正相關，且TLR4與BAMBI、TLR4與p-Samd2/3在BPH組織上皮細胞共表達，提示TLR4與TGF-β/Smad信號通路之間可能通過BAMBI存在信號的交流。
　　3.人前列腺增生上皮BPH-1細胞可以表達TLR4及B

15、AMBI蛋白，不表達p-Smad2/3蛋白，且在LPS作用后TLR4表達上調、BAMBI表達下調，提示TLR4信號可能下調BAMBI表達。
　　4.LPS/TLR4可以通過增強TGF-β/Smad信號途徑誘導BPH-1細胞發(fā)生EMT。
　　5.通過腺病毒轉染技術可以構建BAMBI過表達及低表達的BPH-1細胞系，過表達BAMBI可以抑制BPH-1細胞發(fā)生EMT。提示LPS/TLR4信號可以通過下調BAMBI蛋白的表達，增強T