2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、[目的]
   毛發(fā)-鼻-指(趾)綜合征(trichorhinophalangealsyndrome,TRPSs)是一種以頭皮毛發(fā)、顱面和骨骼發(fā)育異常為特征的遺傳病,主要致病基因?yàn)門rps1。Trps1作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種基因表達(dá),以往研究表明其在軟骨以及毛囊發(fā)育中起重要作用。我們制造并培育Trps1基因敲除(KO)小鼠并對Trps1在腎臟發(fā)育中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)室以往研究證實(shí)Trps1KO小鼠胚胎腎臟間質(zhì)相較野生型(W

2、T)擴(kuò)大,并且發(fā)現(xiàn)這主要是由于敲除Trps1基因后,控制間充質(zhì)細(xì)胞分化的間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)受到影響。Wnt9b和Wnt4原位雜交顯示在Trps1KO小鼠14.5天的胚胎腎中,輸尿管芽分叉以及與之相連的帽間充質(zhì)分布減少。這些發(fā)現(xiàn)均表明,Trps1基因?qū)τ谀I臟發(fā)育中的腎單位形成具有必要作用。由于胚胎期輸尿管芽分支的減少將導(dǎo)致出生后wilms瘤,多囊腎,并增加高血壓,慢性腎病的風(fēng)險(xiǎn),因此對于Trps1基因如何調(diào)控輸尿管芽以及集合管發(fā)育進(jìn)行

3、研究具有臨床意義。此項(xiàng)研究主要探討與揭示Trps1敲除后輸尿管芽及集合管減少的生物分子學(xué)機(jī)制。
   [方法]
   T型輸尿管自胚胎期11.5天Trsp1WT和KO小鼠腎臟中分離,放置于matrigel中培養(yǎng)(生物膠用于器官3D培養(yǎng))。同時(shí)將胚胎期12.5天Trsp1WT和KO小鼠腎臟放置于過濾膜上培養(yǎng)。輸尿管芽培養(yǎng)4天后使用RNeasyMiniKit提取總RNA,并利用DNA基因芯片以及基因芯片3000掃描儀以分析統(tǒng)

4、計(jì)基因在WT和KO兩組間的差異表達(dá)。之后分析Trps1WT和KO胚胎期小鼠腎臟的體內(nèi)基因表達(dá)。首先通過整體原位雜交,實(shí)時(shí)定量PCR和免疫熒光染色確定腎臟發(fā)育正性調(diào)控因子RET和GDNF的表達(dá)水平。由于眾多位于TGF-βSmad3通路中的基因在DNA芯片結(jié)果中有差異,我們利用實(shí)時(shí)定量PCR,westernblot和免疫熒光雙重染色重點(diǎn)分析了通路中的調(diào)控因子Rb(1)cc(1),Arkadial,磷酸化Smad3(psmad3),Smurf

5、2,Smad7,c-Ski和磷酸化p38(pp38)在Trps1WT和KO胚胎腎臟中的表達(dá)位置及表達(dá)量的差異。同時(shí)使用ELISA和免疫熒光雙重染色定位量化確定分泌型TGF-β1蛋白。凋亡與增殖對于輸尿管芽發(fā)育起主要作用,因此我們還通過TUNEL染色及PCNA表達(dá)分析胚胎腎臟中輸尿管芽凋亡與增殖情況。最后,于輸尿管芽和腎臟培養(yǎng)時(shí)添加Smad3抑制劑及TGF-β1,觀察輸尿管芽和腎臟發(fā)育情況。此研究項(xiàng)目中所有統(tǒng)計(jì)分析均通過SPSS13.0進(jìn)

6、行。
   [結(jié)果]
   1.Trps1KO小鼠胚胎腎臟中輸尿管芽分叉和體外培養(yǎng)輸尿管芽相較野生型均受到抑制。于胚胎期14.5天和16.5天輸尿管芽分別減少46%和59%。分離自胚胎期11.5天T型輸尿管芽在WT和KO中無差別,3D培養(yǎng)4天后KO芽尖數(shù)量減少,分支寬度增加。我們首先分析腎臟發(fā)育正性調(diào)控因子RET和GDNF,于12.5天胚胎發(fā)育期中兩者無差別,然而兩者在胚胎期14.5天Trps1KO腎臟中mRNA和蛋白水

7、平開始下降。
   2.DNA芯片分析基因在Trps1WT和KO輸尿管芽表達(dá)差異明顯。為了確定敲除Trps1對于其他腎臟發(fā)育基因表達(dá)的影響,利用DNA微陣列分析培養(yǎng)4天的wT和KO輸尿管芽基因表達(dá)差異。在Trps1KO中,Smad3和ArkadialcDNA分別升高2.67倍和2.26倍,同時(shí)Smad7以及Smurf2作為TGF-β通路的抑制分子降低至少50%。盡管Cpa1,Kdm5d,Hoxa13,和Croxos(1)作為在胰

8、臟導(dǎo)管發(fā)育中重要的基因在DNA芯片結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有表達(dá)變化,然而經(jīng)過進(jìn)一步分析其在WT和KO腎臟中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。GDNF/Ret通路正常情況下正性調(diào)控腎臟發(fā)育,我們分析上下游分子包括分泌因子Wnt11,受體Ret,轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Spry1,和轉(zhuǎn)錄因子Etv4andEtv5。各個基因mRNA水平在兩種基因型小鼠腎臟中均無差異。同時(shí)我們還分析另一重要正性調(diào)控系統(tǒng)成纖維細(xì)胞生長因子FGF通路,其在WT和KO腎臟中也無變化。
   3.TGF

9、-β/Smad3信號通路中的基因在Trps1KO胚胎腎臟中發(fā)生改變。與DNAarray結(jié)果相契合,我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad3信號通路及其調(diào)控因子在不同時(shí)期的Trps1KO胚胎腎臟中均有變化,此結(jié)果進(jìn)一步表明Trps1通過TGF-β/Smad3信號通路控制腎臟和輸尿管芽發(fā)育。Arkadia和Rblccl通過分解Smad7和c-Ski蛋白正性調(diào)控TGF-β/Smad3信號通路,前兩者mRNA和蛋白水平在Trps1KO中明顯升高

10、.后兩者Smad7和c-Ski解離psmad3和smad4的結(jié)合并抑制psmad3向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),其mRNA在Trps1KO胚胎期14.5和16.5天無變化,然而Westernblot和immunofluorescence顯示蛋白質(zhì)于輸尿管芽中明顯降低。Smurf2可解離TGF-β受體與smad3的結(jié)合,蛋白質(zhì)水平在Trps1KO腎臟中也降低。磷酸化smad位于TGF-β通路的中心位置,其往核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控下游多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)pSm

11、ad3穩(wěn)定表達(dá)與Trps1KO輸尿管芽的細(xì)胞核中,特別位于輸尿管芽尖的細(xì)胞核中,然而在野生型腎臟中只有少量psamd3表達(dá)于輸尿管芽細(xì)胞.
   4.進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β1和磷酸化p38(p-p38)在Trps1KO胚胎腎臟中表達(dá)量增加。首先利用Elisa試劑盒發(fā)現(xiàn)分泌型TGF-β1總量在KO腎臟中顯著升高。免疫熒光雙染顯示TGF-β1強(qiáng)染色主要位于Trps1KO胚胎腎臟的帽間充質(zhì)細(xì)胞,輸尿管芽尖,以及腎囊胞。而胚胎期14.

12、5天的野生型腎臟僅有少量陽性染色位于間充質(zhì)細(xì)胞,16.5天的腎臟幾乎無陽性表達(dá)。由于磷酸化p38位于TGF-β下游,并且pp38也可反向正調(diào)控TGF-β的升高,我們檢測pp38在輸尿管芽的表達(dá)量。其表達(dá)位置以及表達(dá)量在Trps1KO腎臟中與TGF-β相同。Westernblot證明在Trps1KO腎臟中pp38蛋白量升高,盡管p38mRNA于WT和KO腎臟中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
   5.Trps1調(diào)節(jié)輸尿管芽細(xì)胞凋亡與增殖。細(xì)胞凋亡

13、與增殖間的平衡對于輸尿管芽分支和腎單位形成起到重要的調(diào)節(jié)作用。PCNA陽性免疫組化染色在Trps1KO腎臟和輸尿管芽中顯著減少,表明Trps1KO腎臟的細(xì)胞增殖降低。TUNEL陽性細(xì)胞在Trps1KO腎臟和輸尿管芽中相比野生型腎臟升高,說明Trps1敲除后,腎臟細(xì)胞凋亡提升。
   6.TGF-β1/Smad3通路直接調(diào)控輸尿管分叉與分化。前面結(jié)果已顯示TGF-β1/Smad3通路中的成員在Trps1KO中表達(dá)變化差異明顯,為了

14、進(jìn)一步證明TGF-β1/Smad3通路直接調(diào)控輸尿管芽的分化,11.5天的輸尿管芽與12.5天的胚胎腎臟在添加了TGF-β1或者Smad3抑制劑SIS3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。大量TGF-β1可以明顯抑制輸尿管芽與腎臟的分化和發(fā)育。與之相反,Smad3抑制劑SIS3增加Trps1KO輸尿管芽的分支,逆轉(zhuǎn)了Trps1基因敲除對于腎臟發(fā)育的抑制作用。
   [結(jié)論]
   1.Trps1基因敲除小鼠的胚胎腎以及體外培養(yǎng)輸尿管芽形態(tài)表

15、型異常,包括分支數(shù)量減少,長度延長以及寬度增加。
   2.Trps1KO胚胎腎臟及輸尿管芽細(xì)胞凋亡增加,增殖減少。
   3.多數(shù)腎臟發(fā)育正性調(diào)控因子在WT和KO之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,然而GDNF和RET在Trps1KO腎臟發(fā)育中表達(dá)降低。
   4.TGF-β/smad3通路過度激活,其組成因子以及調(diào)控因子在Trps1KO胚胎腎臟中表達(dá)改變
   5.TGF-β1和pp38于Trps1KO腎臟中上調(diào),并且

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