新型化學(xué)發(fā)光納米發(fā)光體的制備及其在急性心肌梗死標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用.pdf

1、論文首先綜述了化學(xué)發(fā)光(CL)、CL納米發(fā)光體、無標(biāo)記CL體外診斷分析方法以及急性心肌梗死體外診斷的研究現(xiàn)狀。指出CL分析法具有儀器簡單、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點，已被廣泛用于生物分析領(lǐng)域。其中，無標(biāo)記CL分析技術(shù)由于具有簡單、快速、靈敏的優(yōu)勢，已成為CL生物分析新的發(fā)展趨勢。然而，目前所發(fā)展的無標(biāo)記CL分析方法仍面臨著靈敏度不夠高、需要共反應(yīng)試劑以及檢測精準(zhǔn)度不足等問題，這都大大制約了其在體外診斷分析中的應(yīng)用。急性心肌梗死是目前較為

2、常見的致死疾病之一，雖然在此方面的診斷技術(shù)有了一定的進(jìn)步，但是死亡率依舊沒有得到明顯降低，最重要的原因是缺少有效的急性心肌梗死標(biāo)志物快速靈敏檢測方法。因此，發(fā)展簡單、快速、成本較低的無標(biāo)記分析方法對急性心肌梗死的快速診斷、治療和預(yù)后具有重要的意義。
　　CL納米發(fā)光體具有良好的生物兼容性、易于組裝、高穩(wěn)定性以及高效的發(fā)光效率等優(yōu)點，非常適合用來構(gòu)建納米CL分析界面，進(jìn)而發(fā)展新型高靈敏的無標(biāo)記CL分析方法。因此，本論文圍繞“新型化學(xué)

3、發(fā)光納米發(fā)光體的制備及其在急性心肌梗死標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用”這一主題，開展了一系列工作。首先合成了具有高效CL效率的三種吖啶酯功能化碳納米發(fā)光體，發(fā)現(xiàn)其具有良好的化學(xué)發(fā)光和熒光特性，基于吖啶酯功能化碳納米顆粒納米發(fā)光體的CL和熒光性質(zhì)構(gòu)建了雙模式檢測陣列用于區(qū)分七種過渡金屬離子;其次，合成了具有優(yōu)異電化學(xué)發(fā)光(ECL)活性的半胱氨酸配位的銅離子和N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾雙功能化的金納米發(fā)光體/殼聚糖復(fù)合體以及具有內(nèi)部催化和電位

4、分辨ECL性質(zhì)的納米氧化石墨烯包裹二氧化鈦的納米發(fā)光體，并將其用于構(gòu)建ECL納米分析界面，分別實現(xiàn)了對急性心肌梗死標(biāo)志物和肽素和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)的快速、高靈敏以及精準(zhǔn)檢測。主要內(nèi)容如下:
　　1、我們發(fā)展了一種簡單、通用的方法，利用靜電作用、π-π作用和酰胺鍵作用，將吖啶酯(AE)成功固載在三種碳納米材料的表面，成功制備了吖啶酯功能化碳納米顆粒(AE-CNPs)、氧化石墨烯(AE-GO)、多壁碳納米管(AE-MCNTs)

5、納米發(fā)光體。通過計算得出其吸附在碳納米顆粒、氧化石墨烯、多壁碳納米管表面的吖啶酯含量分別為3.44×10-9、3.27×10-8、3.09×10-8mol/L。此外，在合成三種功能化納米發(fā)光體時所需要的吖啶酯濃度為5.0×10-8mol/L，遠(yuǎn)低于合成其它發(fā)光功能化納米發(fā)光體時所用的發(fā)光試劑濃度。研究表明，上述三種吖啶酯功能化碳納米發(fā)光體均具有優(yōu)異的CL活性和發(fā)光穩(wěn)定性，且由于吸附在碳納米顆粒、氧化石墨烯、多壁碳納米管表面吖啶酯含量的差

6、異，吖啶酯功能化碳納米發(fā)光體的發(fā)光強(qiáng)度順序為:AE-GO＞AE-MCNTs＞AE-CNPs。進(jìn)一步，我們探究了其CL機(jī)理，發(fā)現(xiàn)碳納米材料作為納米尺寸反應(yīng)平臺，能夠有效的促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移和OH·、O2·-的產(chǎn)生，因而產(chǎn)生了強(qiáng)的CL信號。本工作首次合成了具有優(yōu)異CL特性的吖啶酯功能化納米發(fā)光體。對比于沒有功能化的吖啶酯，吖啶酯功能化的碳納米發(fā)光體具有以下優(yōu)勢:(1)將發(fā)光試劑固載在材料表面對于發(fā)展無標(biāo)記CL生物分析是必要的。因此，所制備的吖啶

7、酯功能化碳納米發(fā)光體或許可以用于構(gòu)建無標(biāo)記CL生物分析界面;(2)吖啶酯功能化碳納米發(fā)光體富集了大量信號分子，可大大增強(qiáng)其CL信號。本工作提出的簡單合成策略也可以拓展到其它吖啶酯功能化納米發(fā)光體的制備。此外，合成的AE-CNPs也表現(xiàn)出了激發(fā)依賴的熒光性質(zhì)和優(yōu)異的抗光漂白穩(wěn)定性。我們根據(jù)其優(yōu)異的CL和熒光特性，成功構(gòu)建了能夠成功區(qū)分七種過渡金屬離子的雙模式檢測陣列。
　　2、我們發(fā)展了一種由半胱氨酸配位的銅離子和N-(4-氨丁基)

8、-N-乙基異魯米諾雙功能化的金納米發(fā)光體/殼聚糖復(fù)合體和免疫金納米顆粒組成的發(fā)光免疫金納米組裝體，發(fā)現(xiàn)該發(fā)光免疫金納米組裝體修飾的氧化銦錫電極具有優(yōu)異的ECL性質(zhì)、免疫活性和良好的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個檢測急性心肌梗死標(biāo)志物和肽素的無共反應(yīng)試劑、無標(biāo)記ECL免疫傳感器。在和肽素存在下，由于多肽會阻礙電極上電子的轉(zhuǎn)移而降低該傳感器的ECL信號，根據(jù)降低的ECL信號值，可以實現(xiàn)和肽素從2.0×10-14到1.0×10-11mol/L范

9、圍內(nèi)的測定，且其檢測限為5.18×10-15mol/L，比基于商品化酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒和CL雙抗夾心模式的和肽素傳感器至少低兩個數(shù)量級。該傳感器可以用于健康人血清樣品中和肽素含量的測定，并且此傳感器無需共反應(yīng)試劑和復(fù)雜的標(biāo)記步驟，因此它具有簡單、快速、特異性高和成本低的優(yōu)點。本工作表明發(fā)光免疫金納米組裝體是一種用于發(fā)展無共反應(yīng)試劑和無標(biāo)記的ECL免疫分析的理想納米分析界面。該策略還可以用于檢測其他具有相應(yīng)抗體的目標(biāo)物。此外，該無需共

10、反應(yīng)試劑的ECL免疫分析方法將在基于微流控器件、微芯片和印刷電極的ECL免疫分析領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。
　　3、利用水熱法一步制備了納米氧化石墨烯(nGO)包裹二氧化鈦納米顆粒(TiO2)的nGO@TiO2納米發(fā)光體。研究發(fā)現(xiàn)，該納米發(fā)光體在K2S2O8存在的中性水溶液中，通過一次負(fù)電位掃描即可得到兩個電位分辨的ECL發(fā)射，在-1.27V和-1.85V峰電位下能夠分別觀察到位于510nm的ECL-1和位于535nm的ECL-2，

11、且ECL-1和ECL-2分別來源于nGO@TiO2納米發(fā)光中的TiO2和nGO部分。進(jìn)一步地，通過對比ECL強(qiáng)度，我們發(fā)現(xiàn)nGO@TiO2納米發(fā)光中的nGO和TiO2對彼此的ECL發(fā)射都有顯著的增強(qiáng)作用，說明該納米發(fā)光體中nGO和TiO2之間存在相互催化效應(yīng)，并提出了可能的ECL機(jī)理。ECL-1是由82O82-電還原產(chǎn)生的SO4·-向TiO2價帶中注入空穴，隨后再與其導(dǎo)帶中的電子復(fù)合產(chǎn)生的。在此反應(yīng)過程中，nGO不僅具備優(yōu)異的電子傳遞能

12、力，而且作為納米尺寸反應(yīng)平臺，nGO還可以促進(jìn)OH·的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)SO4·-的產(chǎn)生，增強(qiáng)ECL-1的信號強(qiáng)度。ECL-2是由被電還原的nGO和SO4·-反應(yīng)產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)產(chǎn)物在回到基態(tài)的過程中伴隨的光發(fā)射，而TiO2能夠通過促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移來增強(qiáng)ECL-2的強(qiáng)度。本工作首次合成了具有內(nèi)部催化效應(yīng)和電位分辨ECL性質(zhì)的納米發(fā)光體，對于設(shè)計新型高效的電位分辨ECL納米發(fā)光體提供了新的思路。并且這種在中性水相條件下具有電位分辨ECL性質(zhì)的納米發(fā)

13、光體可用于發(fā)展新型ECL分析探針或分析界面，對于疾病標(biāo)記物的精準(zhǔn)或多元分析具有重要的應(yīng)用前景。
　　4、首次將無標(biāo)記ECL生物分析和比率法結(jié)合起來，發(fā)展了無標(biāo)記ECL比率型生物傳感用于急性心肌梗死患者特異性標(biāo)志物cTnI的檢測，該傳感器是利用具有雙電位分辨ECL性質(zhì)的nGO@TiO2納米發(fā)光體構(gòu)建了集雙ECL信號輸出、放大、識別多種功能為一體的納米ECL傳感平臺。在cTnI存在下，與cTnI有高度親和性的適配體在捕獲cTnI后剛性

14、增加，致使其遠(yuǎn)離電極表面，修飾工作電極上阻抗降低，提高該傳感器的ECL信號強(qiáng)度。由于ECL-1信號強(qiáng)度增加的速率比ECL-2快，因而此雙信號強(qiáng)度的比值隨著cTnI濃度的增加而增大，根據(jù)信號增大的比值可以實現(xiàn)cTnI在1.0×10-13到1.0×10-10mol/L范圍內(nèi)的檢測，其檢測限為3.98×10-14mol/L，比文獻(xiàn)中報道的其他基于無標(biāo)記方法檢測cTnI的傳感器至少低一個數(shù)量級，并且該傳感器可以滿足健康人和急性心肌梗死患者血清中

15、cTnⅠ的檢測需求。本工作構(gòu)建的ECL傳感器具有以下優(yōu)勢:(1)由于它的雙電位ECL信號來源于同一個納米發(fā)光體，因此它比基于標(biāo)記分析技術(shù)的ECL比率法更加簡單、快速。(2)nGO@TiO2具有較好的生物兼容和環(huán)境友好性，且檢測是在中性的水溶液中完成，因此，它可以較好的保持生物分子的活性。(3)此傳感器在負(fù)電位范圍內(nèi)具有雙電位ECL發(fā)射，電位窗口較窄，在1min中內(nèi)即可快速完成檢測?；谝陨蟽?yōu)勢，本工作發(fā)展的無標(biāo)記ECL比率型傳感器在準(zhǔn)確