基于光化學表面改性制備高靈敏度聚合物基基因芯片的研究.pdf

1、近年來，聚合物越來越廣泛地被用作制備生物芯片的基底物質。重要的是:這些材料能被用于多種領域。聚合物具有眾多優(yōu)勢比如低成本，堅固結構，易于構造，快速成型。使用聚合物基質一個重要的優(yōu)點是它們提供了各種各樣的表面性能，在某種情況下還能保留聚合物原有的性能。聚合物生物芯片制備技術是一種真正能代替普通玻璃基微陣列的技術。DNA微陣列體系通常是格式化的微型DNA探針，DNA芯片將有助于診斷和治療的結合以及引入個性化的藥物。生物分子的固定方法分為三類

2、，基于共價結合，物理吸附，或者綁定相互作用的親和力。共價結合常以氨基為基礎。大多數(shù)用于綁定的機理依靠于N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，環(huán)氧基樹脂，醛類，或者碳二酰亞胺，這些都能與生物分子上的氨基共價結合。本課題探討了不同的共價結合方法用于在聚合物表面固定DNA，這對提高監(jiān)測靈敏性和用于特定生物分析的生物芯片的選擇性具有重要意義。本研究主要內容包括：
　?、臗OC有很多優(yōu)良的特性，包括高的玻璃化轉變溫度，低自體熒光，光學透明性和耐有機

3、溶劑等。本研究中，我們使用一種新穎的方法將環(huán)氧基引入到COC表面，基于光催化氧化法(CPO)。首先，利用CPO方法將硫酸根陰離子引入到COC表面，然后硫酸根陰離子通過水解作用轉化成羥基，形成類玻璃表面，之后可以與硅烷偶聯(lián)劑反應。我們選用環(huán)氧丙基三甲氧基硅烷將環(huán)氧基引入到COC薄膜表面，結果用XPS，水接觸角測量儀和原子力顯微鏡表征。通過DNA末端的氨基與引入到COC表面的環(huán)氧基之間的共價結合實現(xiàn)DNA探針在COC表面的固定。不同濃度的D

4、NA探針在COC表面的固定效率在45％～65％之間，與傳統(tǒng)的環(huán)氧化玻片相比相差無幾。得到的DNA微陣列與互補的靶基因實現(xiàn)了成功雜交，雜交后熒光強度是由固定探針的密度或者雜交反應液中靶基因的濃度決定。該方法在低成本的聚合物芯片的構造中有相當大的潛力。
　　⑵EVA是一種被廣泛使用的乙烯共聚物，在EVA中極性的乙烯醋酸酯單元無規(guī)分散在結構中，使得EVA具有良好的柔韌性，光透過性能，并粘附其他有機/無機材料。首先作為光引發(fā)劑的異丙基硫雜

5、蒽酮(ITX)在紫外光下引發(fā)共價結合到EVA表面形成異丙基硫雜蒽酮半頻哪醇(ITXSP)休眠基。固定在聚合物表面的ITXSP可作為一種反應片段來引發(fā)乙烯基單體在可見光下的接枝。帶有環(huán)氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)被用作在EVA表面引入環(huán)氧基的功能性單體。首先在EVA表層可見光輻照接枝一層PEGDA抗污染層，再在表面二次可見光接枝一層功能性的微陣列。用3D結構制備DNA微陣列具有很重要的優(yōu)勢:有更高的固定能力同時在固定分子之間有更長

6、的間距。利用一系列的表征方法證明EVA表面成功引入環(huán)氧基同時獲得了更親水的表面特性。利用原子力顯微鏡可以觀察到二次可見光接枝GMA與PEGDA混合物的EVA表面有規(guī)整的帶有一定高度的三維環(huán)氧反應柱，之后帶有氨基的DNA探針與反應柱上的環(huán)氧基共價結合，利用掃描儀檢測到EVA表面成功固定上了DNA。這為之后的基因檢測以及更廣泛的生物應用提供了有利因素。
　?、侨S水凝膠微芯片的性能相對于二維平面微陣列芯片的優(yōu)點是固定能力高，固定分子周

7、圍有均勻的水環(huán)境，固定化分子與疏水的基質表面沒有接觸，因此增加了芯片固定探針的穩(wěn)定性。本研究開發(fā)了一種新的共聚過程用于三維凝膠反應柱的新型微芯片制備。使用氨基化的DNA，單體選用丙烯酰胺，氨基化的DNA能結合到增長的聚丙烯酰胺鏈上，首先將氨基化的DNA與形成凝膠的丙烯酰胺單體混合，之后用點樣儀將聚合反應的混合物的液滴噴點到LDPE表面進行UV輻照引發(fā)DNA與丙烯酰胺之間的共聚合反應。結果顯示DNA固定前后的固定效率大于80％，說明利用該

8、方法DNA成功地引入到了LDPE表面。LDPE表面固定的凝膠柱的力學和熱學性能都很穩(wěn)定。這為進一步臨床應用提供了依據(jù)。
　?、饶壳芭R床上檢測膠質瘤病變級數(shù)的方法比較復雜而且不準確。利用上述方法制備的LDPE凝膠固定DNA微芯片檢測膠質瘤病變級數(shù)。25條特異性的膠質瘤分級相關基因作為探針與從膠質瘤組織中提取的DNA探針進行雜交，觀察雜交情況確定病變級數(shù)。本研究使用一級和四級病變級數(shù)的膠質瘤組織，先從組織中提取RNA，然后反轉錄成cD