豬巨細(xì)胞病毒gB基因的原核表達(dá)及重組蛋白間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬巨細(xì)胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)感染是在易感豬群中引起的一種以胎兒和仔豬死亡、鼻炎、肺炎及生長發(fā)育不良、增重差等臨床癥狀為特征的條件性疾病。感染動物范圍較窄,僅限于豬。Done于1955年首次于英國分離到本病毒,該病流行呈世界性分布,其中在英國、美國、日本發(fā)病率較高,豬群的PCMV血清抗體陽性率都高于90％,說明凡飼養(yǎng)豬只的地區(qū),都可能有本病毒的感染。
　　 本實驗根據(jù)GenBank收錄的

2、豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)gB基因序列,選擇序列保守性較好的區(qū)域設(shè)計了兩對引物,分別為gB基因檢測引物和gB基因全長引物。對來自江蘇揚(yáng)州、淮安、鹽城和海安等地的仔豬的鼻拭子樣品進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果約43.4％(23/53)檢測為陽性,用全長引物擴(kuò)增出全長為2627 bp的PCMVgB基因序列,與GenBank已收錄的PCMVgB基因的同源性為97.8％～99.4％,編碼的氨基酸序列同源性為97.1％～99.3％。應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行

3、了進(jìn)化樹分析,結(jié)果表明本實驗研究毒株與英國株、德國株和我國的湖南株在同一群。并應(yīng)用DNAStar軟件和相關(guān)生物信息學(xué)網(wǎng)站對gB基因編碼的氨基酸序列生物學(xué)特性進(jìn)行了分析,預(yù)測出gB基因編碼的氨基酸抗原性良好。
　　 根據(jù)GenBank中已收錄的PCMVgB基因序列,選擇抗原富集區(qū)的兩段基因設(shè)計兩對引物(分別命名為PCMVgB1和PCMVgB2),PCR擴(kuò)增gB1、gB2基因,將兩目的片段與原核表達(dá)載體pGEX-6p-1分別經(jīng)Bam

4、HⅠ和SalⅠ酶切,重組構(gòu)建兩個表達(dá)載體(分別命名為pGEX-gB1和pGEX-gB2),測序結(jié)果表明與在GenBank已收錄的序列同源性分別為99.4％和100％。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),由SDS-PAGE電泳分析證實gB1和gB2基因獲得了表達(dá),蛋白分子量分別約為39 Kda和36 Kda,分別命名為GST-gB1和GST-gB2。其中重組蛋白GST-gB1以包涵體的形式存在,GST-gB2以可