日本結(jié)縷草IPT基因遺傳轉(zhuǎn)化及野牛草實生群體內(nèi)遺傳多樣性研究.pdf

1、日本結(jié)縷草和野牛草都是適應(yīng)我國國情的優(yōu)質(zhì)暖季性草坪草。在進(jìn)一步發(fā)展其優(yōu)異的抗逆性同時,創(chuàng)造出具草坪優(yōu)良性狀特別是綠色期延長的新遺傳種質(zhì)是重要的育種目標(biāo)。本研究建立了愈傷組織長期繼代并具有高頻再生能力的培養(yǎng)體系,分析了長期繼代再生植株群體內(nèi)存在的變異；并進(jìn)一步利用該再生體系,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將IPT基因轉(zhuǎn)入日本結(jié)縷草。此外,本研究針對草坪草容易變異的特征,對野牛草實生群體進(jìn)行了形態(tài)與遺傳物質(zhì)多樣性研究,結(jié)果如下:
　　 1、日本

2、結(jié)縷草IPT基因的遺傳轉(zhuǎn)化:
　　 (1)以成熟胚為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織長期繼代高頻再生體系的建立。誘導(dǎo)的胚性愈傷組織繼代間隔時間為30d,在增加0.5×MS基本培養(yǎng)基Fe鹽的繼代培養(yǎng)基上,繼代1-2次可以使愈傷組織的顆粒性增強。長期繼代的愈傷組織分化率降低到0％,但在繼代培養(yǎng)基中添加14mg/L CuSO4預(yù)培養(yǎng)后,分化率可以提高到97％。繼代30個月的愈傷組織切片觀察,與新鮮愈傷組織相似,體胚發(fā)生和器官發(fā)生再生途徑同時存在。

3、
　　 (2)長期培養(yǎng)愈傷組織再生植株的體細(xì)胞變異。以一粒種子誘導(dǎo)的愈傷組織增殖并長期繼代再生的日本結(jié)縷草植株為材料研究發(fā)現(xiàn),其在長期繼代培養(yǎng)中容易發(fā)生變異。形態(tài)指標(biāo)中匍匐莖數(shù)量和長度以及綠色期變異較大,有利于優(yōu)異種質(zhì)的篩選；利用ISSR和RAPD分子標(biāo)記檢測繼代培養(yǎng)再生植株的遺傳多樣性,多態(tài)性位點數(shù)分別為83.6％和72.4％,樣品特異性位點比例分別為15.1％、3.4％,顯示組織培養(yǎng)中體細(xì)胞變異比率較高。兩種分子標(biāo)記遺傳距離

4、矩陣相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著相關(guān)性r=0.2397(P≦0.05),表明兩種不同標(biāo)記都能檢測出再生群體的遺傳多樣性,但I(xiàn)SSR能擴增出更多的特異性帶,在本實驗中對日本結(jié)縷草的體細(xì)胞變異分析,ISSR比RAPD更合適。
　　 (3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的IPT基因的遺傳轉(zhuǎn)化。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,成功地將特異抑制衰老的自我調(diào)控嵌合基因PSAG12∷IPT導(dǎo)入到日本結(jié)縷草的胚性愈傷組織,經(jīng)篩選得到45株抗性植株,經(jīng)田間鑒定轉(zhuǎn)基因株系的枯黃期較

5、野生型推后了15-71d,綠色期有了極大的改善,證明通過PSAG12∷IPT表達(dá)的調(diào)控增加結(jié)縷草體內(nèi)的細(xì)胞分裂素含量以延長其綠色期是確實可行。PCR檢測及Southern雜交,證實IPT已整合到結(jié)縷草的基因組中且得到表達(dá),PCR檢測陽性率達(dá)到51.1％。
　　 2、野牛草實生群體多樣性研究:
　　 從102株實生群體中通過目測形態(tài)篩選出20株有明顯差異的單株,通過表型性狀調(diào)查和ISSR分子標(biāo)記兩種方法對野牛草實生群體的多