鉤苞大丁草的纖維特性及遺傳多樣性研究.pdf

1、鉤苞大丁草（Gerbera delavayi Franch.）又名“火草”、“火石花”，其葉背氈毛纖維是我國西南少數(shù)民族人民編織火草服飾的原料?；鸩菥€的獲得是從鮮葉葉被直接剝離并同時(shí)捻線，這項(xiàng)特殊的紡織技藝已有500多年的歷史，被列為云南省和四川省的非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。目前，還未見關(guān)于鉤苞大丁草的纖維特性方面的報(bào)道。因此，為了深入研究和開發(fā)這一新型天然植物纖維，對(duì)纖維的形態(tài)與結(jié)構(gòu)、化學(xué)成份、物理特性等方面展開研究十分必要。
　　除手工

2、紡織外，鉤苞大丁草還具有較高的藥用和觀賞價(jià)值。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，鉤苞大丁草尚未實(shí)現(xiàn)人工種植，其野生資源已遭到嚴(yán)重破壞，亟待保護(hù)性開發(fā)。遺傳多樣性研究是鉤苞大丁草保護(hù)性開發(fā)的重要依據(jù)，而分子標(biāo)記是揭示遺傳多樣性最理想的方法。為此，本項(xiàng)目將建立由云南省石林彝族自治縣居群(SL)、云南省新平彝族傣族自治縣居群(XP)、云南省武定縣居群(WD)、云南省富源縣居群(FY)、云南省麗江市居群(LJ)、云南省洱源縣居群(EY)、云南省開遠(yuǎn)市居群(KY)、

3、云南省普洱市居群(PE)、四川省德昌縣居群(SDC)共9個(gè)鉤苞大丁草居群構(gòu)成的資源圃。利用基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的genic-SSR熒光標(biāo)記，闡明鉤苞大丁草的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，以期為鉤苞大丁草的保護(hù)性開發(fā)策略提供科學(xué)依據(jù)。
　　1)鉤苞大丁草的葉背纖維特性研究。鉤苞大丁草葉背纖維的化學(xué)成分與棉相似，其蠟質(zhì)含量高出棉的四倍。鉤苞大丁草纖維表現(xiàn)出極低的長度(3-8 mm)、細(xì)度(0.3-0.5dtex)、弱韌性(0.5-0.6 cN/

4、dtex)、密度(0.9 g/cm3)和結(jié)晶度(14.6％)，但其斷裂伸長率、回潮率與棉類似。此外，鉤苞大丁草纖維擁有光滑的表面、柔軟的質(zhì)地，還有不浸潤水的特性。在纖維的收集方法方面，鉤苞大丁草葉片在40℃的熱水中浸泡1分鐘，其捻線長度顯著高于鉤苞大丁草葉片在4℃冷藏10分鐘的處理以及對(duì)照。熱水浴處理后，與對(duì)照相比，纖維的蠟質(zhì)含量下降了20％，且熱穩(wěn)定性更好。纖維的尺寸較小阻礙了鉤苞大丁草纖維的標(biāo)準(zhǔn)紡線以及現(xiàn)代紡織機(jī)器的使用。但這一獨(dú)特

5、的纖維素纖維可在不經(jīng)過任何化學(xué)處理的前提下，單獨(dú)或與其它纖維混合用于手工紡織。今后，更加高效的纖維收集方法、單纖維長、產(chǎn)量高的鉤苞大丁草種質(zhì)篩選及其獨(dú)特的紡織技術(shù)都是有潛力的研究方向。
　　2)鉤苞大丁草的Genic-SSR分子標(biāo)記開發(fā)。從鉤苞大丁草葉片的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中選擇長度大于1000bp的Unigene，使用MISA軟件查找出Genic-SSR位點(diǎn)5179個(gè)，使用primer3軟件設(shè)計(jì)出Genic-SSR引物3464對(duì)。通

6、過位點(diǎn)和引物初選，獲得350對(duì)Genic-SSR引物。從每個(gè)居群隨機(jī)選個(gè)1個(gè)樣本，加接頭引物后進(jìn)行一次擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，篩選出條帶單一且濃度較好的引物61對(duì)。再加熒光引物二次擴(kuò)增，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，上3730測(cè)序儀測(cè)序，最終篩選出21對(duì)特異性高、多態(tài)性好的Genic-SSR引物用于全面擴(kuò)增。
　　3)鉤苞大丁草的遺傳多樣性研究。獲得基因多態(tài)數(shù)據(jù)后，再進(jìn)行21對(duì)引物的中性檢驗(yàn)，選用19對(duì)引物進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析。在9個(gè)

7、野生居群的204個(gè)鉤苞大丁草個(gè)體中，共檢測(cè)出154個(gè)等位基因位點(diǎn)，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目為8。有效等位基因(Ne)總數(shù)為44.7307，平均每個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)目為2.2365。觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的均值分別為0.3049和0.4649。多態(tài)信息含量(PIC)的平均值為0.4317，19個(gè)位點(diǎn)中，有7個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC＞0.5)和7個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25＜PIC＜0.5)。可見，本研究篩選的19個(gè)SSR位點(diǎn)具

8、有較好的多態(tài)性，可用于鉤苞大丁草的群體遺傳研究。
　　9個(gè)野生群體的平均遺傳多樣性偏低(Na=3.8596，Ne=2.0548，I=0.7894，Ho=0.3043，He=0.4152)。除XP外，其余8個(gè)野生群體內(nèi)均有私有等位基因(Np)，平均每個(gè)群體含有5.1111個(gè)私有等位基因，表明各群體內(nèi)存在一定的遺傳變異。此外，9個(gè)野生群體的近交系數(shù)(Fis)平均值為0.2617，表現(xiàn)為純合子過剩。此外，9個(gè)野生群體內(nèi)部均極顯著的偏離哈

9、迪溫伯格平衡，說明各居群內(nèi)近期的交配不遵循隨機(jī)交配模式，等位基因的分布不是很均勻。綜上，9個(gè)野生鉤苞大丁草的群體遺傳一致性較高，遺傳多樣性不是很豐富。
　　4)鉤苞大丁草的遺傳結(jié)構(gòu)研究。在STRUCTURE HARVESTER計(jì)算中，得到的最適delta K值為5，表明9個(gè)野生群體中5個(gè)基因庫的存在。當(dāng)K=5時(shí)，PE的野生個(gè)體的基因組成主要來源于基因庫1，表明PE與其它群體間存在較為明顯的遺傳分化。而其余的8個(gè)野生群體均為其他4個(gè)

10、基因庫的混合，在各基因庫中所占比例較為均勻。可見，鉤苞大丁草9個(gè)野生居群的遺傳結(jié)構(gòu)比較單一。
　　9個(gè)野生群體的遺傳距離都維持在較低水平（均值0.1169）。基于Nei的遺傳距離的UPGMA聚類分析表明:9個(gè)野生群體被大體劃分為了3個(gè)組，位于滇南地區(qū)的PE被單獨(dú)劃為第一組，滇西北地區(qū)的LJ和EY被劃為第二組，滇南東南地區(qū)的KY、滇中地區(qū)的FY、SL、WD、XP和金沙江以北的SDC劃入第三組?；趥€(gè)體的UPGMA圖顯示出組間和群體間

11、的個(gè)體存在著較多的交叉混合，表明群體內(nèi)基因交流頻繁、群體間分化不明顯。
　　PCoA結(jié)果顯示，PE（第一組）與其它2個(gè)組分離明顯，第二組和第三組出現(xiàn)大量的交叉、混合，表明PE與其它2組間的差異較大，第二組和第三組同質(zhì)性高、遺傳關(guān)系較近。這一結(jié)果與STRUCTURE和UPGMA結(jié)論相似。
　　Mantel檢測(cè)結(jié)果顯示，9個(gè)野生鉤苞大丁草群體間的遺傳距離和地理距離有極顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.573），表明地理距離或地理隔離(I

12、BD)對(duì)鉤苞大丁草群體間的遺傳距離具有顯著的影響。
　　9個(gè)野生群體的分子方差分析(AMOVA)表明:大部分的遺傳變異(89.03％)存在于群體內(nèi)部，僅有10.97％的遺傳變異來自于群體間，與STRUCTURE和UPGMA分析結(jié)果相似。FST為0.1097，表明野生群體間存在著中度的遺傳分化?；赨PGMA聚類的3組分子方差分析顯示:大部分的遺傳變異存在于各組內(nèi)(89.41％)，而3組間也僅存在中度的遺傳分化(FST=0.1059

13、)。
　　本項(xiàng)目的開展，建成的鉤苞大丁草資源圃將為其核心種質(zhì)庫的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，為后期的優(yōu)異纖維種質(zhì)篩選、栽培及育種研究提供材料;鉤苞大丁草的遺傳多樣性研究將為其野生資源的保護(hù)性開發(fā)提供科學(xué)依據(jù);轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可為后期的纖維形成機(jī)理、重要基因的深入研究提供參考;Genic-SSR標(biāo)記可為鉤苞大丁草重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析和基因標(biāo)定奠定基礎(chǔ);鉤苞大丁草纖維評(píng)價(jià)有助于人們對(duì)最短的天然紡織纖維——鉤苞大丁草葉背氈毛纖維的深入認(rèn)識(shí)，進(jìn)而促進(jìn)其深度