日本結縷草植株再生體系優(yōu)化及根癌農桿菌介導的遺傳轉化的初步研究.pdf

1、日本結縷草(ZoysiajaponicaSteud.)是一種優(yōu)良的草坪草，它具有耐踐踏、抗高溫干旱、抗寒、耐瘠薄、抗鹽堿和低維護等特性，同時其獨特的地下根莖具有強大的固土護坡和防治水土流失的功能。但作為草坪草，結縷草存在著抗蟲、抗病性差等弱點，尤其綠期短在一定程度上制約了該草種的應用。傳統(tǒng)的有性雜交育種能在一定程度上改良該草種，但其種子不易萌發(fā)、雌花早熟等問題增加了獲得雜種后代的難度。因此，有必要借助現(xiàn)代生物技術育種手段加速該草種的遺傳

2、改良進程。在前人的研究基礎上，本研究進一步優(yōu)化了日本結縷草的植株再生體系，成功地保存了一個具有分化能力的愈傷系，截止2005年4月己達17個月，該愈傷系在繼代培養(yǎng)過程中能保持較高的分化能力；通過對長期繼代的愈傷組織進行組織學切片觀察，分析了愈傷組織分化成苗的發(fā)生途徑；在此基礎上利用gus報告基因對影響根癌農桿菌介導日本結縷草遺傳轉化的條件進行了初步研究，建立了日本結縷草愈傷組織遺傳轉化體系，為結縷草基因工程改良奠定了一定的基礎。主要研究

3、結果如下： 1.日本結縷草植株再生體系的優(yōu)化。以日本結縷草種子為外植體進行愈傷組織誘導，其中誘導培養(yǎng)基中生長素2，4-D最佳有效濃度范圍為2.0-3.0mg/L，加入低濃度細胞分裂素BA(0.01-0.02mg/L)有利于誘導的愈傷組織進一步的長期繼代和分化。結果表明，愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基Ⅰ+2,4-D2.0-3.0mg/L+BA(0.01-0.02mg/L)。 繼代培養(yǎng)基中適當降低2,4-D濃度和添加

4、一定量的KT(0.5mg/L)有利于愈傷組織的保存和分化狀態(tài)愈傷組織的成熟。實驗結果表明，愈傷組織繼代的最佳培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基Ⅱ+2，4-D2.0mg/L+KT0.5mg/L。 愈傷組織成苗的最佳培養(yǎng)基為：MS+NAA0.3mg/L+KT0.5mg/L+BA1.0m/gL。 2.在愈傷組織成苗過程中，大多數(shù)經(jīng)過器官發(fā)生途徑，同時也存在著體細胞胚胎發(fā)生途徑，通過組織切片觀察到了體細胞胚的多個時期。 3.初步建立了

5、以愈傷組織為轉化受體的根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系。以本研究誘導出的愈傷組織為轉化受體進行gus報告基因的遺傳轉化，在轉化過程中對根癌農桿菌菌液濃度、細菌懸浮培養(yǎng)液、侵染時間、以及共培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)方式等轉化條件進行了摸索。實驗表明：日本結縷草的愈傷組織選擇壓力(潮霉素)為45-60mg/L；轉化過程中將活力旺盛的愈傷組織在根癌農桿菌菌液(OD600值為0.20-0.60)侵染18小時以上，在含100μmol/L的乙酰丁香酮的培養(yǎng)基上共