側(cè)柏古樹組織培養(yǎng)再生及其端粒相關(guān)基因克隆研究.pdf

1、古樹是獨(dú)特的風(fēng)景園林資源，是城市人文景觀和自然景觀的綜合載體，但是古樹面臨不同程度衰老甚至死亡的問題，保護(hù)古樹可以充分發(fā)揮其在園林綠化中的重要作用。為了保護(hù)古樹景觀資源，本文以陜西黃帝陵的側(cè)柏古樹為研究對象，以古樹上當(dāng)年生枝條莖尖為外植體，通過組織培養(yǎng)對古樹進(jìn)行克隆，完全保留了古樹的性狀;同時(shí)通過克隆端?；?，在分子水平研究古樹衰老，對古樹復(fù)壯進(jìn)行初步研究。主要的研究結(jié)果如下:
　　1.滅菌方法的選擇:通過對外植體滅菌方法的篩選發(fā)

2、現(xiàn)，側(cè)柏古樹外植體適宜的消毒方法是先用75％酒精處理30 s，無菌水沖洗5次，然后用0.1％ HgCl2消毒8 min，此時(shí)的污染率最低，死亡率也最低，成活率最高，初步解決了側(cè)柏古樹的滅菌問題。
　　2.初代培養(yǎng)基篩選:利用MS、1/2MS、B5、WPM與DKW5種基本培養(yǎng)基對側(cè)柏古樹的外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，經(jīng)一個(gè)月培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基對側(cè)柏古樹嫩枝的組織培養(yǎng)有良好的效果，B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)的效果比1/2MS稍差，誘導(dǎo)率低。MS

3、、WPM與DKW培養(yǎng)基對外植體培養(yǎng)的效果都不理想，可能與培養(yǎng)基本身的營養(yǎng)有關(guān)。然后以1/2MS為基本培養(yǎng)基篩選出了NAA和6-BA適宜的使用濃度，最后得出初代培養(yǎng)最適宜培養(yǎng)基為:1/2MS+0.2 mg/LNAA+0.1 mg/L6-BA。
　　3.增殖培養(yǎng)基篩選:通過對不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、WPM、B5、DKW)和不同激素(6-BA、KT、NAA)組合的優(yōu)化，增殖最適培養(yǎng)基為:1/2MS+0.05 mg/L6-BA+

4、0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L KT。
　　4.生根培養(yǎng)基的篩選:內(nèi)、外源激素的配比關(guān)系對不定根的形成起著決定性的作用。試驗(yàn)表明，在生根培養(yǎng)中WPM效果較1/2MS好，這與初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)時(shí)明顯不同。說明生根階段所需要的營養(yǎng)物質(zhì)有所不同，側(cè)柏古樹最適生根培養(yǎng)基為WPM+0.5mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。
　　5.三個(gè)端粒基因的克隆:應(yīng)用RACE技術(shù)從側(cè)柏中克隆出3個(gè)端?；虻娜L:PoTRF1、

5、PoPOT1和PoKu70。PoTRF1基因長度為1464 bp，包括176 bp5'-非編碼區(qū)(UTR，untranslated region)，和361 bp的3'-UTR，26 bp的polyA尾巴，927 bp的開放閱讀框(ORF, open reading frame)，編碼蛋白質(zhì)的分子量是119 kDa，等電點(diǎn)是5.04。PoPOT1基因長度為1337 bp，包括163 bp5'-UTR，和556bp的3'-UTR，28bp

6、的polyA尾巴，618bp的ORF，編碼蛋白質(zhì)的分子量是110 kDa，等電點(diǎn)是4.98。PoKu70基因長度為1010bp，包括81bp5'-UTR，和368bp的3'-UTR，24bp的polyA尾巴，561bp的ORF，編碼蛋白質(zhì)的分子量是82 kDa，等電點(diǎn)是5.02。在NCBI中BLAST比對發(fā)現(xiàn):PoTRF1、PoPOT1和PoKu70編碼的蛋白質(zhì)序列與擬南芥和楊樹中的同源性分別為54％、43％;54％、44％;和70％、