小麥中幾個與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因的克隆和功能分析.pdf

1、高效遺傳轉(zhuǎn)化體系是小麥基因工程育種的基礎(chǔ)。由于組織培養(yǎng)植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化的低效率，以及功能基因和安全性評價等因素的限制，小麥轉(zhuǎn)基因育種滯后于其他作物。在目前發(fā)展的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化是最為有效的方法，其整個生物學過程非常復(fù)雜，需要一系列農(nóng)桿菌蛋白和植物蛋白相互作用，共同完成外源基因的轉(zhuǎn)入和整合。其中，植物相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)化過程中起著重要作用。本研究擬利用分子生物學手段從小麥中克隆和鑒定幾個與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥和植株再生相關(guān)的基

2、因，對于利用基因工程和細胞工程途徑改良小麥具有重要意義。
　　利用同源序列克隆技術(shù)，以擬南芥AtVIP2基因編碼序列作為種子序列，從普通小麥中克隆了Ta VIP基因，測序結(jié)果表明該基因1839bp，與擬南芥AtVIP2蛋白質(zhì)序列相似性為48％。Southeblotting雜交結(jié)果表明，Ta VIP2在小麥基因組中有3個拷貝。進一步以硬粒小麥與粗山羊草代換系為材料，利用Southern blotting技術(shù)將TaVIP2定位在小麥1

3、A、1B和1D染色體上。分別從小麥AA、DD、SS野生近緣種中擴增出了3個TaVIP2基因的cDNA和gDNA，發(fā)現(xiàn)Ta VIP2基因組序列含有13個外顯子和12個內(nèi)含子。亞細胞定位分析表明，TaVIP2蛋白定位于細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。酵母雙雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaVIP2蛋白與農(nóng)桿菌VirE2蛋白特異性互作。利用農(nóng)桿菌介導法將小麥TaVIP2基因轉(zhuǎn)入煙草和小麥中，發(fā)現(xiàn)過表達小麥Ta VIP2基因能顯著提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草的轉(zhuǎn)化率，同時，增強

4、了煙草對白粉病的抗性。
　　以擬南芥AtVIP1基因編碼序列作為種子序列，利用in silico技術(shù)從普通小麥中克隆了小麥TaVIP1基因，測序結(jié)果表明該基因987bp，編碼328個氨基酸，與擬南芥AtVIP1蛋白質(zhì)序列相似性為51％。Southern blotting雜交結(jié)果表明，TaVIP1在小麥基因組中有3個拷貝。利用定位的小麥ESTs對Ta VIP1進行染色體定位預(yù)測，將該基因定位在5AL、5BL和5DL上。亞細胞定位分析

5、表明，TaVIP1蛋白分布于細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核上。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草結(jié)果表明，過表達TaVIP1基因降低了煙草的轉(zhuǎn)化率。
　　從普通小麥中克隆了Ta WOX5基因的cDNA和gDNA序列，測序發(fā)現(xiàn)小麥TaWOX5基因全長749bp，含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，編碼區(qū)630bp，編碼209個氨基酸，與擬南芥AtWUS蛋白質(zhì)序列相似性為39％。Southern blotting雜交結(jié)果表明，TaWOX5基因在小麥基因組中至少存在9個拷