紅花的組織培養(yǎng)及品質(zhì)相關(guān)的基因克隆.pdf

1、紅花（Flos Carthami）為菊科植物紅花（Carthmus tinctorius L.）的干燥管狀花，具有擴張冠狀動脈、抗凝、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛。其中黃酮類查爾酮成分-羥基紅花黃色素A（HSYA）是紅花的主要活性成分，而羥基紅花黃色素A含量的高低，直接影響紅花品質(zhì)的優(yōu)劣。因此，從cDNA水平研究與HSYA緊密相關(guān)的基因，將為從分子水平調(diào)控紅花品種提供有效途徑，同時從組織培養(yǎng)水平培育無菌苗為轉(zhuǎn)基因育苗做準(zhǔn)

2、備，進一步驗證基因的功能具有重要意義。
　　 本課題組之前的研究從雜交F2代植株含HSYA群體和不含HSYA的群體中通過cDNA-AFLP技術(shù)篩選獲得了兩條與紅花品質(zhì)相關(guān)的差異表達片段（TDF），分別為：只存在于含HSYA群體中的TDF-8，和只存在于不含HSYA群體中的TDF-11。本研究采用HPLC方法對紅花中HSYA的含量進行測定，獲得含HSYA的群體和不含HSYA的群體。根據(jù)HSYA的有無分別建立含羥基紅花黃色素A（HS

3、YA）和不含羥基紅花黃色素A（HSYA）的第一鏈cDNA文庫為RACE（cDNA末端快速擴增）技術(shù)提供基礎(chǔ)。通過TDF-8，TDF-11已知片段序列分別設(shè)計引物，利用RACE技術(shù)分別克隆TDF-8，TDF-11的全長序列，經(jīng)測序拼接，得到TDF-8的全長基因的精確長度為2315bp，含有1257bp長度的開放閱讀框，編碼419個氨基酸，命名為WV-cpl，登錄號為GU380344。生物信息學(xué)分析顯示W(wǎng)V-cpl與蠶豆萎蔫病毒具有高度同源

4、性（97％）。生物信息學(xué)分析和基因保守區(qū)域分析推測該基因?qū)儆谛Q豆萎蔫病毒家族的成員之一，該病毒可能在很久以前侵染紅花，引起紅花自身的保護機制，這種保護機制主要通過產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物黃酮類成分來抵御病毒侵染，最終該病毒與紅花產(chǎn)生共生的關(guān)系，世代演化下來。得到的TDF-11的全長基因的精確長度為1226bp，最大的開放閱讀框不超過141bp，命名為CT-wpr，登錄號為GU227360。生物信息學(xué)分析顯示CT-wpr與毛果楊苷的某個預(yù)測蛋白具

5、有66％的同源性，基因序列分析發(fā)現(xiàn)該基因沒有明顯的開放閱讀框，推測該基因可能為非編碼氨基酸序列，研究表明很多非編碼氨基酸序列對連鎖的基因具有調(diào)控作用，比如抑制和激活的作用。CT-wpr基因可能對和HSYA相關(guān)的基因起調(diào)節(jié)修飾等作用，從而導(dǎo)致該基因的失活或活化，最終使羥基紅花黃色素A（HSYA）在白花中不表達。此外，初步的cDNA文庫的構(gòu)建中，我們獲得一條與查爾酮合酶同源的Contig2566 EST序列，根據(jù)該EST序列設(shè)計引物，利用R

6、ACE技術(shù)克隆出該基因的全長序列為1843bp，含有1164bp長度的開放閱讀框，編碼388個氨基酸，Contig2566推測的氨基酸在蛋白水平比對顯示與多個查爾酮合酶同源性高達70％以上，根據(jù)保守位點及保守序列分析，推測該基因是查爾酮合酶的家族成員之一，查爾酮合酶是查爾酮合成中的關(guān)鍵酶，HSYA屬于查爾酮類成分，因此該基因與HSYA合成存在著緊密的聯(lián)系，對HSYA的含量起著決定性的作用，決定紅花品質(zhì)的優(yōu)劣。為了進一步驗證上述三個以及之