食源性致病菌多重PCR檢測試劑盒的研制與應用.pdf

1、近年來，食品安全事件頻發(fā)，不僅影響到人們的生活、工作和健康，更是關(guān)系到國計民生的大事。在各種食物中毒中，細菌性食物中毒則是食物中毒的主要因素，常見的食源性致病菌包括沙門氏菌屬、變形桿菌屬、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、肉毒梭菌毒素、蠟樣芽胞桿菌、韋氏梭菌、彎曲桿菌、李斯特菌、致病性大腸桿菌、結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌屬。本文針對在我國食物中毒中最常見的致病菌進行研究，尋求食物中毒診斷及食品檢測的有效方法。
　　 本文涉及的食源性

2、致病菌蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、沙門氏(Salmonellaspp)、大腸埃希氏菌0157：H7(E.coli-0157：H7)、志賀氏菌(Shigella spp)、金黃色葡萄球菌（Sta.Aureus）、單增李斯特氏桿菌（Listeria monocy togenes）等菌屬或菌。通過大量的文獻參考和實驗，我們經(jīng)過篩選挑取種或?qū)匍g特異的序列及相應引物，然后用這些引物對各種細菌的基因組序列進行PCR擴增檢測其特異

3、性，最終決定出用于檢測的最優(yōu)的目的基因及沙門氏菌的invA基因、單增李斯特菌溶血素hlyA基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶Nuc基因、志賀氏菌的侵染性質(zhì)粒抗原H基因ipaH、、大腸埃希O157:H7的溶血素基因hlyAB、和致病性蠟樣芽孢桿菌的溶血素hblA基因設計了6對特異性引物,建立兩套三重PCR試劑盒，可同時實現(xiàn)對六種食源性致病菌的檢測。試驗過程中對多重PCR反應體系中引物添加量、鎂離子濃度、dNTPmixture添加量及退火溫度和

4、循環(huán)數(shù)等影響要素進行優(yōu)化，確定了適宜的多重PCR反應體系和擴增程序，即優(yōu)化的三重PCR反應為：50uL反應體系中，dNTP終摩爾量為10pmol，Mg2+75pmol，5U Taq酶，hlyAB、ipaH和hblA終摩爾量分別為5pmol、5pmol和20pmol，invA、hlyA和nuc終摩爾量分別為7.5 pmol、10 pmol和10 pmol，10×PCR反應緩沖液5uL；兩套試劑盒共同的擴增條件為：預變性(94℃，5 min

5、)；28個循環(huán)：變性(94℃,30 s)，退火(58℃,40 s)延伸(72℃,70 s);延伸:(72℃，12min)。對多重PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)建標準質(zhì)粒，進行DNA測序，登錄Genebank將測序結(jié)果進行網(wǎng)上blast，從而證實PCR擴增產(chǎn)物確為目的擴增產(chǎn)物，因此該多重PCR反應特異性較強。
　　 本方法通過人工污染肉及肉制品，同時檢測六種食源性致病菌的靈敏度，O157:H7檢出極限為19.8 cfu/mL，志賀氏菌檢出極限可

6、達17 cfu/mL，蠟樣芽孢桿菌檢出極限為17.7cfu/mL。沙門氏菌檢出極限為4.7 cfu/mL，單核細胞增生李斯特菌檢出極限可達17 cfu/mL，金黃色葡萄球菌檢出極限為4.5 cfu/mL。應用建立的兩套試劑盒，本研究對山東省泰安市及周邊地區(qū)致病菌流行情況進行了調(diào)查監(jiān)測，在各大農(nóng)貿(mào)市場，家禽集散市場，屠宰市場，街道零售商處進行大批量采樣檢測，共取樣502份，包括糞便、羽毛、屠宰沖刷水、屠宰器具、新鮮屠宰雞只、冷凍雞只。其中

7、159樣品檢出沙門氏菌陽性，感染率31.7％，56份樣品檢出蠟樣芽胞桿菌陽性，感染率11.2％,45份樣品檢出O157陽性，感染率9.0％,26份檢出單增李斯特菌陽性，感染率為5.2％,3份檢出金黃色葡萄球菌陽性，感染率為0.6％,3份樣品檢出志賀氏菌陽性，感染率0.6％。將多重PCR方法結(jié)果與國家微生物標準檢驗法進行比較，符合率為為100％。結(jié)論：本研究建立的兩套試劑盒可以同時檢測上述6種病原菌，可用于食品及其原料的生物安全監(jiān)測，也可