人巨細胞病毒UL148抗體檢測試劑盒的研制及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　在前期關(guān)于人巨細胞病毒（HCMV）臨床病毒株UL148基因結(jié)構(gòu)功能系列研究的基礎(chǔ)上，制備UL148抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，明確該功能基因的優(yōu)勢抗原表位，建立檢測HCMV UL148抗體的方法，優(yōu)化檢測體系，進行靈敏性與特異性的評價，觀察不同臨床表型與檢測結(jié)果的相關(guān)性。探討HCMV臨床病毒株UL148抗體檢測試劑盒的開發(fā)與應(yīng)用的前景。
　　方法：
　　1.以課題組前期研究為基礎(chǔ)，將應(yīng)用

2、生物信息學方法篩選的重復(fù)性好、抗原指數(shù)高的3條多肽（P1、P2、P3）作為HCMV UL148基因候選B細胞表位，本課題通過化學合成3條抗原多肽及免疫動物方法，獲取免疫兔血清制備多克隆抗體，應(yīng)用Western Blot鑒定HCMV UL148抗體，確定HCMV UL148 B細胞優(yōu)勢抗原表位。
　　2.化學合成UL148 B細胞優(yōu)勢抗原表位作為包被抗原，通過方陣滴定法選擇包被抗原和血清樣本的最佳工作濃度，通過連續(xù)稀釋法確定酶標二抗

3、的最佳工作濃度，然后包被酶標板制作試劑盒，建立檢測HCMV臨床病毒株UL148抗體的方法。
　　3.以經(jīng)廣東省婦幼保健院臨床確診為CMV性肺炎或CMV性肝炎及實驗室檢測HCMV陽性的血清標本作為實驗組，以未感染HCMV的正常健康兒童作為陰性對照組，應(yīng)用HCMV UL148抗體檢測試劑盒分別對其進行檢測；通過RT-PCR鑒定UL148基因的表達，研究HCMV UL148抗體檢測試劑盒的靈敏性及特異性。
　　4.將實驗組分別按年

4、齡、性別、病種、肝酶學指標、HCMV-IgM值分組，分析HCMV UL148抗體檢測情況，應(yīng)用統(tǒng)計學方法分析HCMV UL148表達在各組中的差異，觀察不同臨床表型與UL148抗體陽性的相關(guān)性，明確HCMV UL148的臨床意義。
　　結(jié)果：
　　1. P1(HCMV UL148265-275)、P2（HCMV UL14818-25）、P3（HCMV UL148221-229）三條多肽均能免疫兔子產(chǎn)生抗體，且抗體效價隨著免疫

5、次數(shù)增加而升高。經(jīng)Western Blot鑒定，證實僅P3段多肽免疫獲得抗體能與臨床病毒株HCMV UL148蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，成為HCMV UL148 B細胞優(yōu)勢抗原表位。
　　2.確定包被抗原P3（1mg/ml）最佳稀釋度為1：160，血清樣本最佳稀釋度為1：100，酶標二抗的最佳稀釋度為1：6000，優(yōu)化了檢測體系，建立了檢測HCMV UL148抗體的方法。
　　3.共收集標本67例，其中實驗組52例，對照組15例，

6、當臨界值為0.246時，52例感染HCMV患兒血清用UL148抗體檢測試劑盒檢測出陽性例數(shù)為22例，陰性為30例；15例未感染HCMV的健康兒童血清中用UL148抗體檢測試劑盒檢測出陽性例數(shù)為0例，陰性例數(shù)為15例；HCMV-UL148抗體檢測試劑盒的靈敏性為81.5％，特異性為100%。
　　4.將實驗組按年齡、性別、病種、肝酶學指標、HCMV-IgM值分組，分析使用HCMV UL148抗體檢測試劑盒的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：≤3月齡組UL

7、148抗體陽性檢出數(shù)高于3-12月齡組，經(jīng)卡方檢驗兩組檢查結(jié)果有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；CMV性肝炎組UL148抗體陽性檢出數(shù)高于CMV肺炎組，經(jīng)卡方檢驗兩組檢查結(jié)果有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；UL148抗體陽性組肝酶學AST、ALT、GGT三項指標均高于UL148抗體陰性組，兩組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；按性別及IgM值等分組UL148抗體陽性檢出率無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)免疫動物及Western

8、 Blot鑒定，確定了P3為HCMV UL148 B細胞優(yōu)勢抗原表位，可作為UL148抗體檢測試劑盒的包被抗原。
　　2.本課題通過確定HCMV UL148B細胞優(yōu)勢抗原表位，建立了檢測HCMV UL148抗體的方法，確立了優(yōu)化檢測體系，進行了靈敏性與特異性的評價，具有開發(fā)研制成人巨細胞病毒UL148抗體檢測試劑盒的前景。
　　3.(1) HCMV UL148基因的表達可能與年齡有關(guān)，3月齡內(nèi)感染HCMV的患兒其UL148基