草酸青霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件優(yōu)化及其基因克隆的初步研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，可水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。它由于是纖維素降解的限速酶而被人們所關(guān)注，目前已被應(yīng)用于許多方面：改善茶葉、果汁的風(fēng)味，生產(chǎn)低聚龍膽糖、大豆異黃酮活性苷元、天然色素梔子藍和天然抗氧化劑多酚化合物等。本課題主要針對β-葡萄糖苷酶的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)及相關(guān)基因克隆4個方面進行了如下研究：
　　 應(yīng)用β-葡萄糖苷酶水解梔子苷生成梔

2、子苷元，梔子苷元在伯氨基酸存在的情況下可交聯(lián)形成梔子藍的原理，設(shè)計了產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的快速篩選培養(yǎng)基，并對實驗室保存的幾種菌株進行了篩選，選出了β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量較高的草酸青霉菌株。
　　 通過單因素優(yōu)化方法對草酸青霉菌株發(fā)酵過程中的溫度、pH、裝液量、碳源、氮源、無機鹽及表面活性劑和刺激劑進行了研究，并運用均勻設(shè)計的方法對影響較大的碳源、氮源、無機鹽和表面活性劑的用量配比進行了研究，通過DPS(Data Processin

3、g System)軟件回歸分析，得到了草酸青霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳條件為：麩皮4％，牛肉膏0.2％，NaCl 0.1％，CuSO4 0.08％，EDTA 0.2％，KH2PO4 0.2％，初始pH7.0，裝液量20mL/250mL，發(fā)酵溫度30℃。優(yōu)化后發(fā)酵液上清中β-葡萄糖苷酶酶活為52.18 U/mL，為最初發(fā)酵條件酶活的3.1倍。
　　 在對β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)：該酶反應(yīng)的最適pH為5.0，最適反應(yīng)溫度

4、為70℃。金屬離子中Ag+對酶反應(yīng)有很強的抑制作用、Mn2+、Al3+對酶活力有顯著的激活作用，F(xiàn)e2+、Fe3+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mg2+、K+對酶活的影響不明顯。有機溶劑的影響：乙醇（10％）、甲醇（10％）、正丁醇（10％-40％）、乙酸乙酯（10％-20％）、丙酮（10％）對酶反應(yīng)都有或多或少的促進作用，但高濃度時則會有較強的抑制作用。酶穩(wěn)定性的研究結(jié)果：該酶在70℃的高溫中T1/2可達20h；