高產(chǎn)耐熱β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株選育及其基因克隆.pdf

1、黑曲霉是常見的安全菌株之一，也是普遍公認的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶較多的菌株。黑曲霉比其它微生物外源基因表達系統(tǒng)(如細菌，酵母)具有諸多優(yōu)點，如高分泌性能、高強度啟動子、完善的翻譯后加工及成熟的發(fā)酵工藝等。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC.3.2.1.21)是纖維素降解過程中的關(guān)鍵酶之一，但其在自然界中含量少、活力低，是限制纖維素酶解技術(shù)發(fā)展的瓶頸。因此，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌，利用微生物手段高效表達β-葡萄糖苷酶對纖維素作

2、為生物質(zhì)能源工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。
　　 本研究從五株黑曲霉中篩選出了產(chǎn)耐熱的β-葡萄糖苷酶菌株(黑曲霉3.316)和產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性較高菌株(黑曲霉3.2130)，并以這兩株菌為研究對象，對黑曲霉高效表達外源β-葡萄糖苷酶基因，做了一些前期基礎(chǔ)性工作：發(fā)酵工藝條件優(yōu)化、低酸性蛋白酶活菌株的誘變、β-葡萄糖苷酶的分離純化及特性研究、β-葡萄糖苷酶基因克隆與序列分析。主要結(jié)果如下：
　　 (1)響應(yīng)面分析法優(yōu)化黑曲霉

3、3.2130產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳工藝為：麩皮用量17g/L、硫酸銨+蛋白胨用量5g/L(1:1，W/W)、水楊苷+CMC用量3g/(1:2，W/W)、初始pH5.0、發(fā)酵瓶裝液量63mL、接種量7mL、搖床轉(zhuǎn)速154r/min，在此條件下發(fā)酵，β-葡萄糖苷酶活力達到1.352U/mL，是初始工藝條件產(chǎn)酶的1.23倍。
　　 (2)黑曲霉3.2130原生質(zhì)體經(jīng)DES誘變，篩選出2株酸性蛋白酶活低的誘變菌株，作為后期基因表達的宿主菌

4、株。
　　 (3)黑曲霉3.316發(fā)酵粗酶液經(jīng)分離、純化得到β-葡萄糖苷酶，經(jīng)SDS-PAGE電泳測定其亞基分子量為127KDa，反應(yīng)最適溫度和pH值分別為60℃和4.4，該酶于65℃下保溫20min，其酶活仍能達到72.6％，屬于耐熱型酶。
　　 (4)利用PCR技術(shù)，以黑曲霉3.316總DNA為模板，擴增得到了大小為2934bp的β-葡萄糖苷酶基因，被命名為bg13.316(GenBank基因序列號為JN969085