家蠅β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重組表達研究.pdf

1、目的：克隆家蠅內源性β-葡萄糖苷酶（beta-glucosidase，BG）基因、建立原核表達和真核表達體系，檢測表達產物活性，了解家蠅內源性BG酶特點，為深入研究家蠅BG酶的獨特性，進一步解釋家蠅極強環(huán)境適應能力和發(fā)現新的種群控制措施提供分子生物學基礎，為發(fā)現新的有效纖維素酶體系提供基礎數據。
　　方法：1.以草地貪夜蛾等結構信息相對完整且研究較為透徹的6種代表性昆蟲的β-葡萄糖苷酶基因序列為參照對象，進行氨基酸同源性分析，設計

2、簡并引物在家蠅cDNA中擴增出家蠅β-葡萄糖苷酶基因(Musca domestica beta-glucosidasegene,bg-1)保守區(qū)域。2.利用5’和3’RACE cDNA末端快速擴增技術從家蠅cDNA中克隆bg-1基因的3’端和5’端cDNA序列，拼接得到bg-1基因的全長cDNA序列并對其進行生物信息學分析。3.根據所得bg-1基因的cDNA序列設計引物擴增bg-1基因成熟肽的基因片段，進而分別采用原核表達載體pET-2

3、8a(+)和pEGX-4T-1構建原核表達體系并在大腸桿菌（E.coli）BL21(DE3)中誘導表達 bg-1基因的融合蛋白（Musca domestica beta-glucosidase fusion protein，BG-1）。4.利用真核表達載體pPICZaA構建表達體系在酵母細胞GS115中表達bg-1基因，并利用制備的多克隆抗體進行免疫印跡對表達蛋白進行驗證。5.采用七葉苷平板顯色法和DNS法檢測各表達體系誘導表達BG-1

4、蛋白的酶活性，并對其性質進行初步的分析。
　　結果：1.利用簡并 PCR技術從家蠅體內克隆得到了長度為1933bp家蠅 bg-1基因的全長cDNA序列，推導其為562個氨基酸殘基組成的蛋白多肽，將其登錄到GenBank，獲得登錄號：JX460804。生物信息學分析結果顯示，所得bg-1基因的融合蛋白具有信號肽，其成熟肽的理論分子量為65020.6Da，等電點為8.16，半衰期大于20h，蛋白性質穩(wěn)定。脂肪族指數為76.83，為親水

5、性蛋白。2.分別構建了家蠅BG酶的pET-28a-bg-1和pEGX-4T-1-bg-1重組表達質粒，采用濃度為1mol/mL異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）進行誘導表達后，在65kDa附近均出現特異性蛋白條帶，并分別利用抗 HIS標簽或抗GST標簽的單克隆抗體進行Westen blot鑒定，證實重組質粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中成功

6、表達，命名為MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。3.構建了家蠅 BG酶的分泌型真核重組表達質粒 pPICZαA-bg-1，并在酵母細胞 GS115中進行表達，以大鼠抗 MDBG-2免疫血清為一抗，辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG為二抗進行Westen blot鑒定，證實家蠅bg-1基因的成熟肽在酵母中成功表達，命名為MDBG-3蛋白。4.采用七葉苷平板法和DNS法對MDBG-1、MDBG-2和MDBG-3進行BG酶活性鑒定和檢測，結果顯示

7、3種表達體系所表達的融合蛋白均具有酶活性，各表達體系的BG酶活性有顯著差異（P<0.05），酶活性水平高低依次MDBG-2　　結論：1.家蠅具有內源性BG酶基因，屬于糖苷水解酶第一家族。2.采用pET-28a（+）和pEGX-4T-1的原核表達體系和畢氏酵母真核表達體系均能誘導表