β-葡萄糖苷酶基因的篩選及性質(zhì)分析.pdf

1、β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），屬于纖維素酶類，是三種纖維素分解酶中的重要組成成分之一，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。β-葡萄糖苷酶有較廣泛的工業(yè)應(yīng)用，可用來降解纖維素生產(chǎn)生物乙醇、改善食品風(fēng)味、轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷化合物、制備低聚龍膽糖、防治病蟲害等。但目前工業(yè)用β-葡萄糖苷酶多數(shù)來源于木霉等真菌，反應(yīng)條件（如溫度、pH）適應(yīng)范圍相對較窄，且

2、酶活力偏低，造成經(jīng)濟成本較高，制約β-葡萄糖苷酶的廣泛應(yīng)用。
　　為獲得酶學(xué)特性優(yōu)良且酶活力高的β-葡萄糖苷酶，本研究用黑龍江玉米秸稈土壤微生物群落成功構(gòu)建了一個高質(zhì)量的宏基因組文庫，并利用功能篩選法從文庫中篩選到一個新型β-葡萄糖苷酶基因bgl2238，該基因全長2238 bp，可編碼745個氨基酸，通過氨基酸序列分析，預(yù)測Bgl2238蛋白分子大小為80.67 kDa，pI值為4.95，是一種結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定、疏水性高且無信號肽序列

3、的酸性蛋白質(zhì)；經(jīng)同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與來源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶（GenBank:WP_048691945.1）具有58％的相似性，屬于GH3超家族和GH3C超家族酶。
　　通過PCR技術(shù)擴增bgl2238基因，并成功構(gòu)建重組表達載體pET-32a（+）-bgl2238，以E. coli BL21（DE3）為宿主菌株，對其進行高效表達。重組Bgl2238菌株表達條件的優(yōu)化結(jié)果顯示，

4、Bgl2238最佳誘導(dǎo)溫度和時間分別為25℃、11 h，IPTG最適誘導(dǎo)濃度為1.0 mM，此時表達量為10.42 U/ml。對重組酶Bgl2238的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)重組Bgl2238最適反應(yīng)pH和溫度分別為6.10，44℃，該酶最大比活達到29.1 U/mg，且在4~50℃范圍內(nèi)，熱處理重組Bgl22384 h后仍保留75%以上的酶活力，熱穩(wěn)定性較好。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為底物時其Vmax=576 u

5、M/min，Km=0.296 mM，以纖維二糖為底物時，其Vmax=572 uM/min，Km=0.543 mM。不同濃度的K+、Na+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Ca2+、Co2+、Zn2+和Ni2+對酶活力均有較大促進作用，其中Fe2+對Bgl2238酶活力的促進作用最大，10 mM Fe2+使酶活力高達260%；低濃度1 mM的SDS、EDTA和咪唑?qū)Ζ?葡萄糖苷酶Bgl2238酶活力有較弱的抑制作用，在100 mM

6、時，SDS、EDTA和咪唑?qū)γ傅囊种谱饔眉訌?；尿素、鹽酸胍和異硫氰酸胍在1 mM時對β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶活力均有促進作用，在高濃度時，Bgl2238酶活力仍分別保留97%、52%、48%。有機溶劑DMSO、甲醇、乙醇、異丙醇、Triton X-100在1 mM時對β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶活力均有促進作用，在高濃度時，對酶均有一定的抑制作用，但令人感興趣的是，DMSO濃度高達100 mM時，Bgl2238的酶活力仍保留

7、85%以上，此外Triton X-100濃度的升高反而促進重組Bgl2238的酶活力，說明重組Bgl2238對有機溶劑有較好的耐受性，在工業(yè)應(yīng)用中具有很好的應(yīng)用前景。葡萄糖作為β-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的產(chǎn)物，對酶促反應(yīng)有一定的反饋抑制作用，但當(dāng)葡萄糖濃度為1.0 M時，Bgl2238剩余酶活為56%左右，表明Bgl2238對葡萄糖有一定的耐受性。
　　將bgl2238基因克隆到酵母表達載體上，并轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株INVSC1中，得到可