BIP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及其對(duì)NOD糖尿病鼠免疫功能的影響.pdf

1、目的：免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)又稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，是熱休克蛋白70家族的成員。BIP作為分子伴侶在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用，但是分泌型BIP也可以在細(xì)胞外發(fā)揮重要作用。分泌型BIP可以誘導(dǎo)自身抗體，與炎性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展相關(guān)；但是也有報(bào)道分泌型BIP亦可以誘導(dǎo)具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能的DC和T細(xì)胞，以及在RA的動(dòng)物模型中可以抑制疾病的進(jìn)展，然而對(duì)其誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的特點(diǎn)及其功能尚待研究闡明。B細(xì)胞一般被認(rèn)為是促進(jìn)免疫反應(yīng)，因?yàn)锽細(xì)胞可以分泌抗體和

2、抗原提呈。但近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)功能，并且發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亦可分為不同亞群，其通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外，許多微環(huán)境中分子和細(xì)胞因子被證明對(duì)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育的起作用，如IL-21、IL-35、BUFF和LPS等也可以影響調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育。分泌型BIP在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育中的作用值得研究。本論文旨在探究微環(huán)境中 BIP在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育中的作用以及BIP處理的B細(xì)胞對(duì)NOD糖尿病鼠免疫功能的影響。
　　方

3、法：⑴通過(guò)ELISA檢測(cè)自身免疫病人血清中BIP及細(xì)胞因子的表達(dá)；⑵通過(guò)熒光抗體單標(biāo)記染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BIP誘導(dǎo)脾細(xì)胞表面分子的表達(dá)；⑶通過(guò)熒光抗體多標(biāo)記染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BIP誘導(dǎo)脾細(xì)胞多重表面分子的表達(dá)，以及細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)；⑷ELISA檢測(cè)BIP誘導(dǎo)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的表達(dá)；⑸通過(guò)蛋白熒光偶聯(lián)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BIP與B細(xì)胞的結(jié)合；⑹通過(guò)磁珠分選B細(xì)胞和多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BIP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的表型特征；⑺通過(guò)CFSE，7-AD

4、D染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖；⑻通過(guò)NOD糖尿病鼠模型檢測(cè)BIP處理的B細(xì)胞對(duì)NOD小鼠免疫功能的影響。
　　結(jié)果：①與正常人的血清標(biāo)本比較，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中BIP水平高于正常對(duì)照組，并且BIP表達(dá)和RF，IL-10表達(dá)呈正相關(guān)；②采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞表面分子的表達(dá)，結(jié)果顯示BIP可以誘導(dǎo)脾細(xì)胞表達(dá)PD-L1和FasL，并誘導(dǎo)CD19的表達(dá)增強(qiáng)；③CD19, CD5熒光抗體雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，B

5、IP可誘導(dǎo)CD19+CD5+雙陽(yáng)性細(xì)胞增加；④CD19，PD-L1或PD-L2熒光抗體雙染流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，BIP可誘導(dǎo)CD19+PD-L1+雙陽(yáng)性細(xì)胞增加；⑤CD19，F(xiàn)asL熒光抗體雙染流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，BIP可誘導(dǎo)CD19+FasL+雙陽(yáng)性細(xì)胞增加；⑥采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞和CD19+細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果表明BIP可以誘導(dǎo)CD19+IL-10+雙陽(yáng)性細(xì)胞增加和IL-10分泌；⑦采用熒光素標(biāo)記BIP

6、和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了可溶性BIP與CD19+B細(xì)胞結(jié)果表明表明大部分的CD19+細(xì)胞可以與BIP結(jié)合；⑧多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，BIP可以誘導(dǎo)C57BL/6小鼠CD19+細(xì)胞中表型為CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+IL-10+細(xì)胞擴(kuò)增；⑨細(xì)胞功能檢測(cè)結(jié)果表明 BIP誘導(dǎo)的CD19+細(xì)胞可以促進(jìn) T細(xì)胞的增殖，提示BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞在體外可以抑制T細(xì)胞的功能；⑩BIP誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對(duì)N

7、OD鼠胰島炎進(jìn)展影響不明顯，但可以降低淋巴結(jié)中活化的CD8+T細(xì)胞的比例，其效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。
　　結(jié)論：⑴BIP可以誘導(dǎo)表型為CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+ IL-10+細(xì)胞擴(kuò)增,表明BIP可以誘導(dǎo)B1a來(lái)源的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；⑵BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞在體外可以抑制T細(xì)胞的增殖，表明BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞在體外可以抑制T細(xì)胞的功能；⑶BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞輸注給NOD糖尿病鼠可以降低淋巴結(jié)中活