BIP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細胞及其對NOD糖尿病鼠免疫功能的影響.pdf

1、目的：免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)又稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，是熱休克蛋白70家族的成員。BIP作為分子伴侶在細胞內(nèi)發(fā)揮重要作用，但是分泌型BIP也可以在細胞外發(fā)揮重要作用。分泌型BIP可以誘導(dǎo)自身抗體，與炎性關(guān)節(jié)炎的進展相關(guān)；但是也有報道分泌型BIP亦可以誘導(dǎo)具有負性調(diào)節(jié)功能的DC和T細胞，以及在RA的動物模型中可以抑制疾病的進展，然而對其誘導(dǎo)免疫細胞的特點及其功能尚待研究闡明。B細胞一般被認為是促進免疫反應(yīng)，因為B細胞可以分泌抗體和

2、抗原提呈。但近年來，發(fā)現(xiàn)B細胞也具有調(diào)節(jié)功能，并且發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細胞亦可分為不同亞群，其通過不同的機制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外，許多微環(huán)境中分子和細胞因子被證明對調(diào)節(jié)性B細胞分化發(fā)育的起作用，如IL-21、IL-35、BUFF和LPS等也可以影響調(diào)節(jié)性B細胞分化發(fā)育。分泌型BIP在調(diào)節(jié)性B細胞分化發(fā)育中的作用值得研究。本論文旨在探究微環(huán)境中 BIP在調(diào)節(jié)性B細胞分化發(fā)育中的作用以及BIP處理的B細胞對NOD糖尿病鼠免疫功能的影響。
　　方

3、法：⑴通過ELISA檢測自身免疫病人血清中BIP及細胞因子的表達；⑵通過熒光抗體單標記染色流式細胞術(shù)檢測BIP誘導(dǎo)脾細胞表面分子的表達；⑶通過熒光抗體多標記染色流式細胞術(shù)檢測BIP誘導(dǎo)脾細胞多重表面分子的表達，以及細胞內(nèi)分子的表達；⑷ELISA檢測BIP誘導(dǎo)脾細胞培養(yǎng)上清細胞因子的表達；⑸通過蛋白熒光偶聯(lián)流式細胞術(shù)檢測BIP與B細胞的結(jié)合；⑹通過磁珠分選B細胞和多色流式細胞術(shù)檢測BIP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細胞的表型特征；⑺通過CFSE，7-AD

4、D染色流式細胞術(shù)檢測B細胞和T細胞的增殖；⑻通過NOD糖尿病鼠模型檢測BIP處理的B細胞對NOD小鼠免疫功能的影響。
　　結(jié)果：①與正常人的血清標本比較，在類風濕關(guān)節(jié)炎病人血清中BIP水平高于正常對照組，并且BIP表達和RF，IL-10表達呈正相關(guān)；②采用流式細胞術(shù)檢測小鼠脾細胞表面分子的表達，結(jié)果顯示BIP可以誘導(dǎo)脾細胞表達PD-L1和FasL，并誘導(dǎo)CD19的表達增強；③CD19, CD5熒光抗體雙染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，B

5、IP可誘導(dǎo)CD19+CD5+雙陽性細胞增加；④CD19，PD-L1或PD-L2熒光抗體雙染流式細胞術(shù)分析結(jié)果表明，BIP可誘導(dǎo)CD19+PD-L1+雙陽性細胞增加；⑤CD19，F(xiàn)asL熒光抗體雙染流式細胞術(shù)分析結(jié)果表明，BIP可誘導(dǎo)CD19+FasL+雙陽性細胞增加；⑥采用流式細胞術(shù)和ELISA檢測小鼠脾細胞和CD19+細胞細胞因子的表達，結(jié)果表明BIP可以誘導(dǎo)CD19+IL-10+雙陽性細胞增加和IL-10分泌；⑦采用熒光素標記BIP

6、和流式細胞術(shù)檢測了可溶性BIP與CD19+B細胞結(jié)果表明表明大部分的CD19+細胞可以與BIP結(jié)合；⑧多色流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，BIP可以誘導(dǎo)C57BL/6小鼠CD19+細胞中表型為CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+IL-10+細胞擴增；⑨細胞功能檢測結(jié)果表明 BIP誘導(dǎo)的CD19+細胞可以促進 T細胞的增殖，提示BIP誘導(dǎo)的B細胞在體外可以抑制T細胞的功能；⑩BIP誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性B細胞對N

7、OD鼠胰島炎進展影響不明顯，但可以降低淋巴結(jié)中活化的CD8+T細胞的比例，其效應(yīng)有待進一步研究。
　　結(jié)論：⑴BIP可以誘導(dǎo)表型為CD19+CD5+PD-L1+，CD19+CD5+FasL+，CD19+CD5+ IL-10+細胞擴增,表明BIP可以誘導(dǎo)B1a來源的調(diào)節(jié)性B細胞；⑵BIP誘導(dǎo)的B細胞在體外可以抑制T細胞的增殖，表明BIP誘導(dǎo)的B細胞在體外可以抑制T細胞的功能；⑶BIP誘導(dǎo)的B細胞輸注給NOD糖尿病鼠可以降低淋巴結(jié)中活