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文檔簡介
1、目的:免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)又稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78,是熱休克蛋白70家族的成員。BIP作為分子伴侶在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用,但是分泌型BIP也可以在細(xì)胞外發(fā)揮重要作用。分泌型BIP可以誘導(dǎo)自身抗體,與炎性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展相關(guān);但是也有報(bào)道分泌型BIP亦可以誘導(dǎo)具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能的DC和T細(xì)胞,以及在RA的動物模型中可以抑制疾病的進(jìn)展,然而對其誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的特點(diǎn)及其功能尚待研究闡明。B細(xì)胞一般被認(rèn)為是促進(jìn)免疫反應(yīng),因?yàn)锽細(xì)胞可以分泌抗體和
2、抗原提呈。但近年來,發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)功能,并且發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亦可分為不同亞群,其通過不同的機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外,許多微環(huán)境中分子和細(xì)胞因子被證明對調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育的起作用,如IL-21、IL-35、BUFF和LPS等也可以影響調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育。分泌型BIP在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育中的作用值得研究。本論文旨在探究微環(huán)境中 BIP在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞分化發(fā)育中的作用以及BIP處理的B細(xì)胞對NOD糖尿病鼠免疫功能的影響。
方
3、法:⑴通過ELISA檢測自身免疫病人血清中BIP及細(xì)胞因子的表達(dá);⑵通過熒光抗體單標(biāo)記染色流式細(xì)胞術(shù)檢測BIP誘導(dǎo)脾細(xì)胞表面分子的表達(dá);⑶通過熒光抗體多標(biāo)記染色流式細(xì)胞術(shù)檢測BIP誘導(dǎo)脾細(xì)胞多重表面分子的表達(dá),以及細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá);⑷ELISA檢測BIP誘導(dǎo)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的表達(dá);⑸通過蛋白熒光偶聯(lián)流式細(xì)胞術(shù)檢測BIP與B細(xì)胞的結(jié)合;⑹通過磁珠分選B細(xì)胞和多色流式細(xì)胞術(shù)檢測BIP誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的表型特征;⑺通過CFSE,7-AD
4、D染色流式細(xì)胞術(shù)檢測B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖;⑻通過NOD糖尿病鼠模型檢測BIP處理的B細(xì)胞對NOD小鼠免疫功能的影響。
結(jié)果:①與正常人的血清標(biāo)本比較,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中BIP水平高于正常對照組,并且BIP表達(dá)和RF,IL-10表達(dá)呈正相關(guān);②采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾細(xì)胞表面分子的表達(dá),結(jié)果顯示BIP可以誘導(dǎo)脾細(xì)胞表達(dá)PD-L1和FasL,并誘導(dǎo)CD19的表達(dá)增強(qiáng);③CD19, CD5熒光抗體雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,B
5、IP可誘導(dǎo)CD19+CD5+雙陽性細(xì)胞增加;④CD19,PD-L1或PD-L2熒光抗體雙染流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,BIP可誘導(dǎo)CD19+PD-L1+雙陽性細(xì)胞增加;⑤CD19,F(xiàn)asL熒光抗體雙染流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,BIP可誘導(dǎo)CD19+FasL+雙陽性細(xì)胞增加;⑥采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測小鼠脾細(xì)胞和CD19+細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá),結(jié)果表明BIP可以誘導(dǎo)CD19+IL-10+雙陽性細(xì)胞增加和IL-10分泌;⑦采用熒光素標(biāo)記BIP
6、和流式細(xì)胞術(shù)檢測了可溶性BIP與CD19+B細(xì)胞結(jié)果表明表明大部分的CD19+細(xì)胞可以與BIP結(jié)合;⑧多色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,BIP可以誘導(dǎo)C57BL/6小鼠CD19+細(xì)胞中表型為CD19+CD5+PD-L1+,CD19+CD5+FasL+,CD19+CD5+IL-10+細(xì)胞擴(kuò)增;⑨細(xì)胞功能檢測結(jié)果表明 BIP誘導(dǎo)的CD19+細(xì)胞可以促進(jìn) T細(xì)胞的增殖,提示BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞在體外可以抑制T細(xì)胞的功能;⑩BIP誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對N
7、OD鼠胰島炎進(jìn)展影響不明顯,但可以降低淋巴結(jié)中活化的CD8+T細(xì)胞的比例,其效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。
結(jié)論:⑴BIP可以誘導(dǎo)表型為CD19+CD5+PD-L1+,CD19+CD5+FasL+,CD19+CD5+ IL-10+細(xì)胞擴(kuò)增,表明BIP可以誘導(dǎo)B1a來源的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞;⑵BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞在體外可以抑制T細(xì)胞的增殖,表明BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞在體外可以抑制T細(xì)胞的功能;⑶BIP誘導(dǎo)的B細(xì)胞輸注給NOD糖尿病鼠可以降低淋巴結(jié)中活
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