Ⅰ白介素-17調(diào)節(jié)致糖尿病性T細(xì)胞介導(dǎo)的NOD鼠1型糖尿病的發(fā)生;Ⅱ長(zhǎng)期飲酒減少大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞PBR和StAR表達(dá).pdf

1、目的: ①研究逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染BDC T細(xì)胞能否穩(wěn)定的表達(dá)和分泌IL-17； ②研究siIL-17能否在BDC T細(xì)胞的基因表達(dá)中抑制IL-17基因的表達(dá)。 ③觀察IL-17轉(zhuǎn)基因BDC T細(xì)胞體內(nèi)能否誘導(dǎo)NOD.scid轉(zhuǎn)移性糖尿病的發(fā)生，以及siIL-17能否通過(guò)BDC T細(xì)胞基因表達(dá)抑制IL-17的表達(dá)和體內(nèi)抑制糖尿病的發(fā)生。④研究IL-17對(duì)1型糖尿病發(fā)病影響的機(jī)理。 研究方法: 1、IL-

2、17和siIL-17的病毒載體的構(gòu)建： 借助于MSCV-IRES-Thy1.1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過(guò)基因重組的方法攜帶IL-17基因；以Thy1.1作為病毒載體上的目的基因的檢驗(yàn)標(biāo)志；以攜帶抗凋亡基因Bcl2的重組MIT和空載體MIT為陽(yáng)性對(duì)照；以空白轉(zhuǎn)導(dǎo)作為陰性對(duì)照。 以pMND-BANSHEE逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，插入U(xiǎn)6增強(qiáng)子和Thy1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)志，構(gòu)成了完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。siIL-17插入其多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了siI

3、L-17逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 2、Phoenix細(xì)胞生產(chǎn)病毒顆粒： Phoenix細(xì)胞培養(yǎng)和傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在鈣.磷轉(zhuǎn)導(dǎo)試劑的作用下，加入目的病毒DNA，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)即可收獲攜帶目的基因的病毒上清。轉(zhuǎn)染前后使用Thy1.1抗體和流式細(xì)胞儀鑒定Phoenix細(xì)胞。 3、BDC T細(xì)胞的活化： 以anti-mouse CD3和anti-mouse CD28體外共刺激脾細(xì)胞約24小時(shí)后，通過(guò)標(biāo)記CD

4、4和Vβ4抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BDC T細(xì)胞的性質(zhì)；標(biāo)記CD69和CD62L抗體鑒定T淋巴細(xì)胞的活化率。 4、BDC T細(xì)胞的病毒感染和IL-17的表達(dá)： 目的病毒感染BDC T淋巴細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Thy1.1和Thy1.2抗體標(biāo)記的雙陽(yáng)性T細(xì)胞的百分率并篩選出。ELISA檢測(cè)雙陽(yáng)性T細(xì)胞培養(yǎng)液IL-17表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染效果。 5、轉(zhuǎn)基因BDC T細(xì)胞的接種及效果： 通過(guò)目的病毒感染，大量生

5、產(chǎn)轉(zhuǎn)基因BDC T細(xì)胞，以抗體-磁珠篩選的方法，篩選出Thy1.1/Thy1.2雙陽(yáng)性細(xì)胞并注射N(xiāo)OD.scid鼠，以注射BDC T細(xì)胞和PBS作為陰性對(duì)照組，觀察動(dòng)物血糖變化。 6、ELISA方法檢測(cè)NOD.scid小鼠血漿腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)、干擾素-gamma(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)以及白細(xì)胞介素-4(IL-4)，并送檢胰腺進(jìn)行病理檢查，及流式細(xì)胞學(xué)檢查脾臟和胰腺淋巴結(jié)。 結(jié)果:

6、1、細(xì)胞克隆生產(chǎn)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒為分別攜帶目的基因IL-17和siIL-17的病毒DNA.測(cè)序和酶切結(jié)果和預(yù)期結(jié)果完全一致。 2、攜帶目的基因的病毒載體轉(zhuǎn)染Phoenix包裝細(xì)胞：抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞學(xué)鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)Phoenix細(xì)胞呈Thy1.1陰性，轉(zhuǎn)導(dǎo)后， MIT空載體、重組Bcl2-MIT質(zhì)粒、重組IL-17質(zhì)粒和siIL-17質(zhì)粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)率分別是(96.14±4.2)％，(93.2±2.2)％，(93.5±3.2)％和(89.5

7、±4.7)％，與空白對(duì)照組(0.4±0.1)％相比，均有顯著性差異(P＜0.01)。 3.BDC T細(xì)胞的活化：分別用CD4/CD69和CD4/CD62L抗體標(biāo)記活化前、后的脾細(xì)胞，與活化前比較，活化后BDC T細(xì)胞比例增加，活化前、后CD4+/CD69+細(xì)胞和CD4+/CD62L-細(xì)胞的比例分別由(3.4+1.5)％和(8.6+2.8)％提高至(33.74±6.9)％和(25.54±5.3)％，提示CD4+細(xì)胞處于較理想的被轉(zhuǎn)

8、染狀態(tài)。 4.攜帶目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染活化的T淋巴細(xì)胞：在Mock空白對(duì)照組、MIT空載體組，Bcl2陽(yáng)性對(duì)照組、IL-17組和siIL-17組中，Thy1.1+/Thy1.2+細(xì)胞比例分別為(0.64±0.3)％，(7.2±2.4)％，(6.84±2.6)％，(6.44±2.4)％和(4.6±1.8)％。 5、轉(zhuǎn)基因BDC T細(xì)胞的篩選和鑒定：以Thy1.1、Thy1.2和BDC2.5TCR抗體標(biāo)記被篩選的細(xì)胞，并

9、進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析顯示：①經(jīng)Thy1.25和IBDC2.5TCR抗體標(biāo)記證實(shí)被篩選的細(xì)胞是BDC2.5 T細(xì)胞，②與篩選前對(duì)比，Thy1.1和Thy1.2抗體標(biāo)記的雙陽(yáng)性IL-17轉(zhuǎn)基因細(xì)胞從(5.14±2.4)％提高到(97.2±1.2)％，siRNA-IL-17轉(zhuǎn)基因細(xì)胞從(4.64±1.6)％提高到(83.2±6.3)％。 6.轉(zhuǎn)基因NOD/BDC T細(xì)胞IL-17的體外表達(dá)：IL-17轉(zhuǎn)基因T淋巴細(xì)胞的IL-17水平顯著

10、升高，活化后可進(jìn)一步促進(jìn)IL-17的表達(dá)。siIL-17轉(zhuǎn)基因T淋巴細(xì)胞可顯著抑制IL-17的表達(dá)，IL-17的水平顯著降低。 7、NOD.scid鼠血糖監(jiān)測(cè)和組織學(xué)檢查： 至觀察期結(jié)束，注射IL-17轉(zhuǎn)基因BDC T細(xì)胞的NOD.scid小鼠血糖顯著升高，全部小鼠均發(fā)生糖尿病，而注射siIL-17細(xì)胞的NOD.scid小鼠、陰性對(duì)照組和BDCT細(xì)胞組無(wú)一例發(fā)病。胰腺組織學(xué)H&E染色發(fā)現(xiàn)注射IL-17轉(zhuǎn)基因BDC T細(xì)胞

11、的NOD.scid小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的胰島炎和胰島結(jié)構(gòu)破壞，模糊不清。而注射silb-17的轉(zhuǎn)基因NOD.scid小鼠和BDC T細(xì)胞組多表現(xiàn)為輕、中度胰島炎，陰性對(duì)照組表現(xiàn)為正常胰島。 8、NOD.scid鼠血漿IL-17、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-4水平： 注射IL-17BDC T細(xì)胞的小鼠血漿IL-17、TNF-α、IFN-γ和IL-6水平均顯著高于siIL-17小鼠和對(duì)照組(P＜0.01)，而siIL-17小鼠

12、各項(xiàng)血漿細(xì)胞因子水平與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。血漿IL-4水平在IL-17小鼠中未測(cè)出，在siIL-17小鼠和對(duì)照組中極低。未能檢測(cè)出NOD.scid小鼠血漿各項(xiàng)細(xì)胞因子。 9、流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，在IL-17糖尿病發(fā)病組，脾臟和胰腺淋巴結(jié)BDC T增殖和聚集增多，樹(shù)突細(xì)胞(DC)細(xì)胞顯著增加。 結(jié)論: 1、以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體攜帶IL-17和siIL-17基因轉(zhuǎn)染BDC T細(xì)胞，可以體外獲得顯著高表達(dá)

13、的IL-17 BDC T細(xì)胞和低表達(dá)IL-17 BDC T細(xì)胞，而siIL-17基因表達(dá)可以有效抑制BDC T細(xì)胞中IL-17的表達(dá)。 2、Phoenix包裝細(xì)胞是一個(gè)安全有效的逆轉(zhuǎn)錄病毒“包裝機(jī)”。 3、轉(zhuǎn)移高表達(dá)IL-17的轉(zhuǎn)基因BDC T淋巴細(xì)胞可誘發(fā)和加速NOD.scid鼠糖尿病的發(fā)生，表達(dá)siIL-17的BDC T細(xì)胞可通過(guò)抑制IL-17的表達(dá)抑制NOD.scid鼠糖尿病的發(fā)生。 4、IL-17可刺激自

14、身的BDC T活化，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞胰島浸潤(rùn)，并通過(guò)促進(jìn)DC活化和BDC T細(xì)胞釋放TNF-α、IFN-γ、IL-6細(xì)胞因子和抑制IL-4細(xì)胞因子，最終破壞胰島D細(xì)胞，誘發(fā)糖尿病。 5、DC細(xì)胞可以通過(guò)抗原遞呈介導(dǎo)高表達(dá)IL-17的BDC T細(xì)胞活化增殖和胰島β細(xì)胞損害。 基于上述研究現(xiàn)狀，為了更深入的認(rèn)識(shí)乙醇與PBR、StAR的關(guān)系和對(duì)睪酮的作用機(jī)理，本研究確定研究目的與方法如下： 目的: 1、通過(guò)對(duì)大

15、鼠睪丸組織染色，觀察乙醇對(duì)大鼠睪丸組織的基本影響； 2、檢測(cè)大鼠血清睪酮水平，了解乙醇對(duì)大鼠血清睪酮的抑制作用： 3、檢測(cè)乙醇喂養(yǎng)大鼠睪丸StAR mRNA的表達(dá)水平；檢測(cè)睪丸組織PBR和StAR的表達(dá)，了解乙醇對(duì)PBR和StAR在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上的影響； 4、明確PBR和StAR在睪丸組織中的定位，觀察定位組織蛋白表達(dá)情況。 研究方法: 1、動(dòng)物模型培養(yǎng)。為檢測(cè)慢性乙醇對(duì)大鼠睪丸組織的影響

16、，Wistar大鼠隨機(jī)分成四組，每組給予不同劑量的乙醇胃管灌注，每天一次，共20周。麻醉后處死，迅速取睪丸置于液氮保存或4％多聚甲醛中固定、脫水、包埋，制成組織蠟塊備用。 2、采用H&E染色，顯示睪丸組織的乙醇影響狀況。 3、采用羅氏全自動(dòng)E170電化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定大鼠血清睪酮水平。 4、采用RT-PCR檢測(cè)StAR mRNA水平；采用免疫共沉淀和Western-blot檢測(cè)PBR和StAR蛋白水平。 5、采用免疫