溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生體系的優(yōu)化.pdf

1、溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella[L.]Merr.）又名馬尼拉，是一種優(yōu)良的暖季型草坪草，被廣泛應(yīng)用于暖溫帶及過渡地區(qū)。因其無法產(chǎn)生種子，故在自然界通過匍匐莖進(jìn)行無性繁殖，無法采用雜交育種等傳統(tǒng)方法進(jìn)行遺傳改良。因此，轉(zhuǎn)基因及體細(xì)胞無性系變異等生物技術(shù)在溝葉結(jié)縷草育種、抗性和觀賞性改良中有著重要的作用。
　　 本試驗以繼代了8年的溝葉結(jié)縷草匍匐莖所誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為材料，比較了不同生長調(diào)節(jié)劑（BA和ZR）及其濃度（0

2、.00、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/L）組合、不同氨基酸種類（L-Pro、L-Arg、 L-Glu）、不同固化劑種類(Phytagel、Gelzan、Agar、Carrageenan、 Agargellan)、不同接種大小(1、2、3、4mm)、不同培養(yǎng)容器（柱形瓶、三角瓶和培養(yǎng)皿）以及不同輻射劑量(0、20Gy)的60Coγ射線對愈傷組織再生的影響，以優(yōu)化溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織的再生條件。同時，對愈傷組織再生過程進(jìn)行

3、了超微結(jié)構(gòu)觀察以更深入了解其再生。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織再生率隨著生長調(diào)節(jié)劑的改變而發(fā)生明顯改變，隨著生長調(diào)節(jié)劑濃度從0.00提高至0.40 mg/L，胚性愈傷組織再生率在2.5％～70.0％之間變化。低濃度（0.05 mg/L）的BA能夠刺激愈傷組織再生，而隨著BA濃度的增加，愈傷組織的再生率顯著降低;另一方面，在未添加BA的培養(yǎng)基上，胚性愈傷組織的再生率隨著ZR濃度的提高并未表現(xiàn)

4、出顯著性差異。結(jié)果顯示在含有0.05 mg/L的BA和ZR培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織的再生率達(dá)到最高(70.0％)，且平均總不定芽數(shù)最多(109.5)。
　　 2.含有500 mg/L L-Glu培養(yǎng)基上其再生率(18.0％)與對照組的再生率(30.0％)未存在顯著差異(p＞0.05)，而添加同濃度L-Arg和L-Pro顯著抑制了愈傷組織的再生(p＜0.05)，其中在含有L-Arg的培養(yǎng)基上再生率及再生力最低，分別為8.0％和74.

5、5％。
　　 3.在含不同固化劑的再生培養(yǎng)基上，胚性愈傷組織的再生力差異并不顯著。Agargellan上的胚性愈傷組織顯示最高的再生率(39.0％)，Agar及Carrageenan培養(yǎng)基上的愈傷組織再生率分別為32.0％、27.0％，與Agargellan上并無顯著差異(p＞0.05)，然而，常用的Phytagel培養(yǎng)基上愈傷組織再生率僅為19.0％，此外，無論是Sigma公司還是CP Kelco公司，所產(chǎn)的Gelzan都顯示

6、出較低的再生率（分別為21.0％、12.0％）。
　　 4.試驗結(jié)果顯示，當(dāng)胚性愈傷組織接種直徑分別為1mm、2mm、4mm時，再生率沒有顯著差異，分別為21.0％、19.0％、18.0％，與接種直徑為3mm的胚性愈傷組織的再生率(68.0％)具有顯著性差異。
　　 5.試驗在柱形瓶中觀測到最高的再生率(64.0％)，與三角瓶(7.0％)和培養(yǎng)皿(13.0％)中的具有顯著性差異，而三者再生力之間并無顯著性差異。
　

7、　 6.輻射劑量為20Gy時，胚性愈傷組織具有更強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力，膨大至5mm的愈傷組織小塊能達(dá)到95.0％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未經(jīng)輻射的胚性愈傷組織(80.0％)。但其胚性愈傷組織的再生率(20.0％)顯著(p＜0.05)低于未經(jīng)輻射處理的愈傷組織(71.0％)。
　　 7.電鏡掃描顯示溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織發(fā)生屬于體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，其過程與狗牙根等暖季型草坪草的發(fā)生相似。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞較小，細(xì)胞內(nèi)含物豐富，