石斛MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因克隆和功能初步研究.pdf

1、石斛屬（Dendrobium）植物是蘭科（Orchidaceae）的附生植物，它是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。
　　 目前，對石斛屬植物進(jìn)行基因克隆及其功能研究在國內(nèi)外報道甚少，在藥用石斛研究中，通過對優(yōu)良基因的克隆，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠快速實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移并克隆出具有經(jīng)濟價值的目的基因。從石斛中克隆分離藥用因子基因、抗逆基因、促生長開花基因等具有潛在經(jīng)濟價值的目的基因來提高石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)。
　　 本實驗采用TAIL-PCR技

2、術(shù)，通過對實驗室cDNA文庫中已知的小片段信息設(shè)計引物，對金釵石斛基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，得到一個片段的基因組DNA并根據(jù)序列信息設(shè)計TAIL-PCR引物進(jìn)行TAIL-PCR擴增，最終獲得已知序列側(cè)翼的未知序列并拼接成一條完整的具ORF閱讀框的基因序列，共克隆獲得3條基因，兩條MYB基因和一條EREB基因，并全部構(gòu)建了克隆載體和表達(dá)載體，我們從中選取了一條MYB基因來深入研究，并將其命名為DnMYB1，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因

3、及熒光定量PCR驗證其功能。
　　 通過Gateway系統(tǒng)的克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建技術(shù)，并利用農(nóng)桿菌GV3001將基因DnMYB1轉(zhuǎn)移至模式植物擬南芥中，在轉(zhuǎn)基因擬南芥的T2和T3代觀察其表型變化和該目標(biāo)基因的表達(dá)變化，以及該基因的擬南芥同源基因的表達(dá)變化。過量表達(dá)DnMYB1的轉(zhuǎn)基因擬南芥各個株系的表型變異顯著，其中刺毛明顯減少甚至沒有，整個葉片表面呈光滑狀，莖也是光滑無刺毛存在；RNAi擬南芥各株系，葉片在幼苗期還有少許的