菊花CmMYB59轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、菊花為我國(guó)十大名花，因其花色艷麗、花型多樣，深受人們喜愛(ài)，具有很大觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量和功能最多樣的的轉(zhuǎn)錄因子之一，在植物伸長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。本研究克隆了一個(gè)菊花CmMYB59轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其表達(dá)特性、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性等進(jìn)行了研究，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，研究其對(duì)根伸長(zhǎng)的影響，同時(shí)為菊花種質(zhì)創(chuàng)新提供新的種質(zhì)資源。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以菊花品種‘神馬’為實(shí)驗(yàn)材料，利用RT-PCR與RACE等

2、技術(shù)克隆得到一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子的cDNA全長(zhǎng)序列，并發(fā)現(xiàn)了其一種可變剪切。該基因全長(zhǎng)904bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?68bp，編碼255個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量61.99KD，等電點(diǎn):4.99 kD。同源性分析表明，此基因?yàn)榈湫偷腞2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥的AtMYB59同源性較高，具有保守的R2R3結(jié)構(gòu)域和調(diào)控基序YNSMDEIW，因此命名為CmMYB59（GenBank登錄號(hào):KR052024）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明CmM YB9與丹

3、參、玉米的親緣關(guān)系較近，與其他物種較遠(yuǎn)。
　　2.通過(guò)熒光定量分析了‘神馬’CmMYB59的組織、非生物脅迫和開(kāi)花期的表達(dá)特性。結(jié)果表明:CmMYB59在根中表達(dá)最高，莖、葉中次之，莖尖和花器官中最低;隨著花芽分化進(jìn)程，葉中CmMYB59表達(dá)量逐漸升高，在小花原基分化末期達(dá)到頂峰，隨后降低;低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)CmMYB9的表達(dá)，而高溫脅迫、鹽脅迫、ABA處理后，CmMYB59的表達(dá)量均表現(xiàn)出2h內(nèi)短暫下降隨后迅速升高的趨勢(shì)。由此可知，

4、CmMYB59可能參與菊花花芽分化的過(guò)程，并且參與了菊花多種脅迫過(guò)程，包括低溫、高溫、鹽脅迫等，而響應(yīng)時(shí)間和表達(dá)幅度的差異則說(shuō)明CmMYB59對(duì)其調(diào)控機(jī)制不同。構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pMDC43-GFP-CmMYB59，并將其轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞。亞細(xì)胞定位分析顯示，CmMYB9蛋白定位于細(xì)胞核上。構(gòu)建酵母表達(dá)載體pDEST-GBKT7-CmMYB59，通過(guò)酵母單雜交的方法驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄激活活性，結(jié)果表明，CmMYB9具有轉(zhuǎn)錄激活活性。<

5、br>　　3.構(gòu)建超表達(dá)載體pMDC43-CmMYB59，將CmMYB59分別轉(zhuǎn)入擬南芥和菊花品種‘神馬’中，通過(guò)潮霉素抗性篩選及RT-PCR鑒定，分別獲得超表達(dá)的菊花轉(zhuǎn)基因株系Z2、Z6和擬南芥轉(zhuǎn)基因株系L1、L3。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L1、L3和野生型WT擬南芥進(jìn)行花期觀察和主根長(zhǎng)測(cè)量，花期觀察結(jié)果為超表達(dá)株系與野生型花期一致，無(wú)明顯差異，表明CmMYB9對(duì)花期無(wú)直接影響;根伸長(zhǎng)結(jié)果表明，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)小于WT的根長(zhǎng)。擬南芥細(xì)