利用基因組改組技術(shù)提高SubtilosinA的產(chǎn)量及AurantininB的結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、SubtilosinA是一種特殊結(jié)構(gòu)的羊毛硫類細(xì)菌素，該分子在半胱氨酸的硫原子和兩個(gè)苯丙氨酸及一個(gè)蘇氨酸的a-位形成共價(jià)，被分為第一類細(xì)菌素中新的第四亞類。SubtilosinA具有較廣的抑菌范圍，不僅能夠抑制包括炭疽芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽孢桿菌、無(wú)乳鏈球菌、單核增生李斯特菌等多種革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，對(duì)革蘭氏陰性菌，如加德納氏菌、索氏志賀菌、產(chǎn)氣腸桿菌等也有一定的抑制作用。此外，SubtilosinA對(duì)pH、加熱、紫外照射還具

2、有較好的穩(wěn)定性。因此，SubtilosinA在食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的廣泛應(yīng)用前景。
　　但目前SubtilosinA的發(fā)酵產(chǎn)量仍停留在比較低的水平，一定程度上限制了它的進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)室保藏了一株產(chǎn)SubtilosinA的Bacillus subtilis A1B2-2，但其產(chǎn)量也比較低，本研究主要利用分離純化手段獲得較純的SubtilosinA，在HPLC上建立定量檢測(cè)方法，以利用基因組改組技術(shù)提高菌株中Subtilo

3、sinA的產(chǎn)量;同時(shí)測(cè)定了SubtilosinA的生物效價(jià);并對(duì)Bacillus subtilis A1B2-2中分離純化出的另一抗菌物質(zhì)進(jìn)行鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　1.建立SubtilosinA的定量檢測(cè)方法并測(cè)定SubtilosinA的生物效價(jià)。將Bacillussubtilis nj aA1 B2-2的發(fā)酵液去除菌體后通過(guò)酸沉淀、有機(jī)溶劑抽提、柱層析、半制備型HPLC、冷凍干燥等過(guò)程，建立了SubtilosinA的分離

4、純化方法。并在HPLC上建立了發(fā)酵液中SubtilosinA的檢測(cè)曲線y=0.0609x-5.2240，該方法在3.75～600mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9982，檢出限是9.375 mg/L，定量限為14.05mg/L，精密度為1.65％，樣品純度在95％以上。測(cè)定了Nisin效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=109.87x-301.01，并以此測(cè)得1g SubtilosinA的生物效價(jià)是9.93×106 U。
　　2.通過(guò)理

5、化誘變選育高產(chǎn)SubtilosinA的菌株。以實(shí)驗(yàn)室保藏的Bacillus subtilisA1B2-2為出發(fā)菌株進(jìn)行γ射線誘變，篩選出一株高產(chǎn)SubtilosinA的菌株nja4-43。在原生質(zhì)體形成和再生的最佳條件下，即以高鹽作為洗滌系統(tǒng)，在0.1mg/ml溶菌酶的作用下酶解40min后涂布在以SMM配制的NB再生培養(yǎng)基上，此時(shí)原生質(zhì)體形成率達(dá)到95.49％,再生率為89.25％。之后利用紫外誘變、亞硝酸誘變以及復(fù)合誘變分別對(duì)nja

6、4-43的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，并獲得SubtilosinA產(chǎn)量增高的三株菌nja N2-99、nja Z1-53、nja H1-65。
　　3.利用基因組改組技術(shù)選育高產(chǎn)SubtilosinA的菌株。將經(jīng)過(guò)誘變得到的四株高產(chǎn)菌株nja4-43、nja N2-99、nja Z1-53、nja H1-65采用電融合的方式進(jìn)行兩輪基因組重排，以滅活親本原生質(zhì)體作為融合子檢出的方式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原生質(zhì)體紫外滅活最佳條件:18W，15cm，2

7、5min.熱滅活最佳條件:100℃，19 min。滅活后的原生質(zhì)體放置在RAD-BIO電穿孔儀中設(shè)置脈沖電壓150V，脈沖寬度100ms，個(gè)數(shù)9，間隔10s，使原生質(zhì)體排列成串后靜置1min，設(shè)置原生質(zhì)體電穿孔條件:脈沖電壓1200V，脈沖寬度為0.5ms，脈沖個(gè)數(shù)為2，脈沖間隔為5s，再生率達(dá)到1.39×10-3。經(jīng)過(guò)兩輪基因組重排后，獲得遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株R2-264，產(chǎn)量達(dá)17.59mg/L，比出發(fā)菌株提高了3.8倍。

8、>　　4.活性抗菌物質(zhì)的鑒定。在分離純化Bacillus subtilis nja A1B2-2粗蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)另一抗菌活性物質(zhì)。經(jīng)HR-ESI-MS分析，獲得該抗菌物質(zhì)精確分子量為780.4858，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)該物質(zhì)可能為AurantninB。之后通過(guò)全波長(zhǎng)掃描獲得該抗菌物質(zhì)紫外吸收峰為239、279、288、306、318nm，與AurantininB的紫外吸收值較為一致，且利用MS2和MS3分析獲得該物質(zhì)的碎片峰和Auranti