應(yīng)用基因組改組技術(shù)選育廣域pH耐受的谷氨酸高產(chǎn)菌株.pdf

1、谷氨酸是一種典型的傳統(tǒng)大宗發(fā)酵產(chǎn)品,在其發(fā)酵控制中,pH是一項(xiàng)重要參數(shù)。篩選廣域pH耐受的谷氨酸高產(chǎn)菌株,有利于在實(shí)際生產(chǎn)中減少液氨和濃硫酸用量,降低生產(chǎn)過(guò)程中粗放操作對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量造成的影響。本文利用基因組改組技術(shù)選育廣域pH耐受的谷氨酸高產(chǎn)菌,經(jīng)過(guò)2輪改組,得到了4株優(yōu)良菌,并通過(guò)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)對(duì)改組菌與原始菌進(jìn)行了DNA多態(tài)性分析。
　　 本課題首先考察了實(shí)驗(yàn)室保藏的九株谷氨酸生產(chǎn)菌的pH耐受性和發(fā)酵特性。其中

2、SW07-01、SW07-02和T613-85,在低pH條件下表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì);SW07-01、SW07-03和T613-85具有較強(qiáng)的高pH耐受能力;發(fā)酵產(chǎn)酸量最高的是SW07-01和SW07-06。因此,SW07-01確定為基因組改組的原始出發(fā)菌。
　　 本文建立了一套基于細(xì)胞培養(yǎng)板的通量篩選方法:首先通過(guò)極端pH平板進(jìn)行預(yù)篩,挑選耐受性較強(qiáng)的單菌落至含有。pH指示劑的發(fā)酵培養(yǎng)基平板培養(yǎng),將產(chǎn)生變色圈的菌株接種至細(xì)胞培養(yǎng)

3、板發(fā)酵初篩,挑選產(chǎn)酸大于原始菌產(chǎn)量95％的突變菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,產(chǎn)量大于原始菌的即為篩得菌株。
　　 SW07-01培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中前期(約5 h),對(duì)其進(jìn)行X射線誘變及DES誘變。利用建立的篩選方法篩選得到7株優(yōu)良菌株,其中低pH耐受性提高的四株菌:D-D-2-2、D-D-2-3、D-D-2-17、X-D-8和高pH耐受性提高的三株案例菌:D-G-6-13、D-G-6-32、D-G-7-2。以上述七株誘變菌株為母本進(jìn)行第一輪基

4、因組改組,得到了三株pH耐受性有所提高并且產(chǎn)酸優(yōu)于原始菌的F1代改組菌F1-1-1、F1-1-4和F1-2-2。再以F1代改組菌為母本進(jìn)行第二輪改組,篩選得到了F2-1-17、F2-2-7、F2-8-18、F2-9-11四株廣域pH耐受的谷氨酸高產(chǎn)菌株。
　　 對(duì)F2代改組菌、F1代改組菌、誘變菌和原始菌的pH適應(yīng)性及發(fā)酵特性進(jìn)行了比較。原始菌的耐受pH范圍為5.0-10.8,經(jīng)過(guò)誘變和改組,菌株的pH耐受性得到提高,其中F1代

5、菌株中,低pH耐受可至4.8,高pH最高可至11.2;F2代菌株中最大pH耐受范圍是4.6.11.4。搖瓶中F2代改組菌平均產(chǎn)酸較原始菌提高了76.7％,其中最高的:F2-2-7提高了93.3％,5 L攪拌發(fā)酵罐中,F2代平均產(chǎn)酸較原始菌平均提高23.0％,其中F2-2-7發(fā)酵36h,谷氨酸產(chǎn)量106 g/L,較原始菌提高了68.3％。
　　 并且,采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法比較了F2代改組菌和原始出發(fā)菌的DNA多態(tài)