基因組改組選育高產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株.pdf

1、β-半乳糖苷酶常簡稱為乳糖酶，在食品、藥品、保健品行業(yè)的應(yīng)用潛力很大。關(guān)于乳糖酶酶活提高，目前國內(nèi)外研究主要從以下幾個(gè)方面著手：
　　 1，從工業(yè)發(fā)酵方面，主要是培養(yǎng)基優(yōu)化，誘導(dǎo)因子的添加以及發(fā)酵模式，條件和提取工藝的優(yōu)化，分離提純等；
　　 2，篩選高產(chǎn)菌株，誘變育種；
　　 3，酶的改性技術(shù)；
　　 4，尋找比較高效表達(dá)系統(tǒng)；目前常用原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，如Torres等將枯草桿菌KL88的β-

2、半乳糖普酶基因片段克隆至大腸桿菌系統(tǒng)得到的β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量比天然β-半乳糖苷酶高25-143倍；
　　 5，基因工程菌技術(shù)，重組DNA技術(shù)，對(duì)乳糖酶基因在分子水平上進(jìn)行改造，從而定向篩選目標(biāo)蛋白，得到理想變異。常用的研究方法有易錯(cuò)PCR，DNA shuffling，定點(diǎn)誘變等等；如姜世民等利用異源DNA同源重組體外定向進(jìn)化大腸桿菌的β-半乳糖苷酶。國內(nèi)對(duì)乳糖酶的研究起步較晚，到20世紀(jì)80年代才開始對(duì)乳糖酶進(jìn)行研究。

3、　　 到目前為止已報(bào)道出一些乳糖酶的產(chǎn)生菌株，包括霉菌，細(xì)菌，酵母菌以及某些動(dòng)植物。國外近年來對(duì)乳糖酶分子生物學(xué)方面研究比較多，嗜酸乳桿菌NCFM菌株的基因組已經(jīng)完成測序，為從基因工程方面提高乳糖酶的酶活打下基礎(chǔ)。
　　 本課題選取基因重組的途徑來提高目標(biāo)酶活，首先以傳統(tǒng)發(fā)酵條件優(yōu)化嗜酸乳桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶，然后進(jìn)行DNA shuffling，定向篩選提高酶活。通過基因重組途徑獲得的酶活結(jié)果進(jìn)行比較，分析野生型菌株的β-半乳

4、糖苷酶酶活與突變體菌株所產(chǎn)生的目標(biāo)酶活之間的區(qū)別，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，比較分析酶活差異性。
　　 嗜酸乳桿菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件為：牛肉膏10g/L、酪蛋白胨10g/L、醋酸鈉7.5g/L、硫酸鎂150mg/L、硫酸錳35mg/L、磷酸氫二鉀3g/L、葡萄糖5g/L、接種量5%、碳酸鈣10g/L、檸檬酸三胺2.35g/L、酵母粉6.22g/L、發(fā)酵溫度36℃、發(fā)酵時(shí)間為24h、轉(zhuǎn)速為低速50

5、r/min。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該營養(yǎng)條件下的酶活力最大可達(dá)到3.98U/L，是優(yōu)化前菌株的2.9倍。
　　 以嗜酸乳桿菌CICC6075為出發(fā)菌株，經(jīng)基因組改組篩選出了一株具有較高酶活的高產(chǎn)菌株，菌株編號(hào)為嗜酸乳桿菌L.acidophilus-F2-10。該菌株所產(chǎn)的乳糖酶以O(shè)NPG為底物進(jìn)行反應(yīng)，酶活較誘變前有明顯提高，酶活達(dá)到了7.56U/L，提高了4.6倍。改組菌所產(chǎn)β-半乳糖苷酶以O(shè)NPG為底物的酶學(xué)性質(zhì)為：最適溫度45℃，最

6、適pH值是pH7，在40℃-50℃和pH6.0-9.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。Mg2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Al3+對(duì)此酶有明顯的激活作用，而Cu2+、Zn2+、Ca2+對(duì)酶有較強(qiáng)抑制作用，K+對(duì)酶幾乎沒有影響。
　　 實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)方法，依據(jù)生物數(shù)據(jù)庫對(duì)改組菌L.acidophilus-F2-10菌株β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行了PCR克隆和測序，β-半乳糖苷酶基因lacLM全長2834個(gè)堿基，協(xié)同翻譯編碼兩個(gè)亞基，分

7、別為628個(gè)aa，316個(gè)aa。對(duì)照野生型菌株進(jìn)行基因比對(duì)和氨基酸比對(duì)，基因突變位點(diǎn)有5處，lacL基因編碼的大亞基氨基酸突變位點(diǎn)有4處突變，其中3處同義突變，以ATG編碼的M氨基酸為第一位標(biāo)數(shù)，除第512位氨基酸R→H突變，第72位氨基酸S→S突變，245位Q→Q突變，247位G→G突變都為同義突變。lacM基因編碼的小亞基氨基酸突變位點(diǎn)有1處突變Y→H。整章實(shí)驗(yàn)分析了基因突變位點(diǎn)與氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系，推測出了改組菌