雪蓮菌菌相分析及抗癌活性研究.pdf

1、雪蓮菌，又稱西藏靈菇、藏靈菇，英文名Tibetan Kefir Grain，是一種對(duì)牛乳等有發(fā)酵作用的天然混菌體系。本文以采集自我國(guó)4個(gè)不同地區(qū)的雪蓮菌樣品為研究對(duì)象，研究了其菌相組成及抗癌活性。雪蓮菌樣品分別為：TK-ZJUJ01來(lái)源于拉薩，TK-ZJUJ02來(lái)源于成都，TK-ZJUJ03來(lái)源于烏魯木齊，TK-ZJUJ04來(lái)源于西寧。
　　 通過(guò)傳統(tǒng)的菌種鑒定方法，分離純化鑒定到了各個(gè)雪蓮菌樣品中的可培養(yǎng)微生物：TK-ZJUJ

2、01中分離純化得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus)，以及釀酒酵母菌(Saccharomyce cerevisiae)；TK-ZJUJ02中分離純化得到開菲爾乳桿菌(Lactobacilluskefiri)，kudriavzevii畢赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)，馬克斯克魯維酵母

3、菌(Kluyveromyces marxianus)，單孢釀酒酵母菌(Kazachstania unispora)；TK-ZJUJ03中分離純化得到乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，單孢釀酒酵母菌(Kazachstania unispora)，馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianu

4、s)，exigua釀酒酵母菌(Kazachstania exigua)；TK-ZJUJ04中分離純化得到植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，fabarum醋酸菌(Acetobacter fabarum)，單孢釀酒酵母菌(Kazachstania unispora)，季也蒙畢赤酵母菌(Pichia guilliermondii)。其中Pichia kudriavzevii和Pichia guilliermondi

5、i兩種酵母菌是第一次在雪蓮菌中發(fā)現(xiàn)。
　　 通過(guò)宏基因組學(xué)高通量測(cè)序的方法對(duì)4個(gè)雪蓮菌樣品進(jìn)行了細(xì)菌組成多樣性分析，得到了更全面的細(xì)菌組成結(jié)果。在4個(gè)雪蓮菌樣品中，共鑒定到11個(gè)屬：乳球菌屬(Lactococcus)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，醋酸菌屬(Acetobacter)，明串珠菌屬(Leuconostoc)和鏈球菌屬(Streptococcus)，希瓦氏菌屬(Shewanella)，不動(dòng)桿菌屬(Acinet

6、obacter)，(Pelomonas)屬，(Dysgonomonas)屬，魏斯氏菌屬(Weissella)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，其中后6個(gè)屬是第一次在雪蓮菌中發(fā)現(xiàn)。α-多樣性及β-多樣性分析表明，不同來(lái)源的雪蓮菌其細(xì)菌菌相組成雖然不同，但多樣性程度相近，雪蓮菌中的菌相在“種”的水平上組成各有不同，但在“屬”的水平上組成穩(wěn)定。主成分分析(PCA)分析表明，對(duì)雪蓮菌的菌相組成多樣性貢獻(xiàn)最大的三個(gè)屬分別為乳桿菌屬(Lact

7、obacillus)，乳球菌屬(Lactococcus)和醋酸菌屬(Acetobacter)。
　　 通過(guò)對(duì)4個(gè)雪蓮菌菌粒的復(fù)配培養(yǎng)得到了最優(yōu)重組菌粒TK-ZJUJ06。菌相分析表明，重組菌粒菌相組成多樣性程度降低，細(xì)菌組成中的優(yōu)勢(shì)菌相乳桿菌屬(Lactobacillus)，乳球菌屬(Lactococcus)及醋酸菌屬(Acetobacter)等組成穩(wěn)定而風(fēng)險(xiǎn)菌相比例下降；而酵母菌經(jīng)分離純化只鑒定到釀酒酵母(Saccharomy

8、ce cerevisiae)。發(fā)酵性能測(cè)定表明，TK-ZJUJ06發(fā)酵性能及揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生穩(wěn)定，將TK-ZJUJ06作為進(jìn)一步研究對(duì)象。
　　 噻唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)(MTT)、流式細(xì)胞儀(FCM)及實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)分析表明，雪蓮菌TK-ZJUJ06發(fā)酵乳Cell-free fraction對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖具有抑制作用，并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)作用濃度為8 mg mL-1時(shí)，癌細(xì)胞存活率為22％，抑制作用

9、顯著。進(jìn)一步的機(jī)制探討表明，雪蓮菌TK-ZJUJ06發(fā)酵乳Cell-free fraction能夠阻遏人胃癌細(xì)胞SGC7901由Gl期向S期的過(guò)渡，并通過(guò)上調(diào)bax基因(從3.30±0.19上調(diào)至14.25±0.31)和下調(diào)bcl-2基因(從9.50±0.23下調(diào)至4.72±0.11)的表達(dá)量而誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞發(fā)生早期(50.41%)及晚期凋亡(9.89%)。
　　 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(RSM)優(yōu)化了雪蓮菌粒TK-ZJUJ06