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文檔簡介
1、目的:篩選調控腫瘤細胞 cell-in-cell結構形成的基因,并研究基因調節(jié)cell-in-cell結構形成的機制。
內容和方法:我們取同種組織不同來源的乳腺瘤細胞,給以相同的培養(yǎng)條件,懸浮相同數(shù)量的細胞,對細胞進行免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下統(tǒng)計細胞cell-in-cell形成率;收集同等量腫瘤細胞Trizol裂解液,均分為兩份,將其中的一份樣品委托公司使用基因芯片技術采集細胞樣品中各個基因的熒光信號;借助軟件分析,可聚類
2、分析出不同樣品之間表達差異的基因,將基因歸類并挑選出部分基因,設計針對每個基因的qPCR引物,提取另一份細胞樣品的mRNA,以同等量的mRNA為模板,反轉錄出cDNA,再以cDNA為模板,分別擴增各個基因,利用實時熒光定量 PCR儀精確得到樣品各個基因的相對表達量;選取MDA-MB-436細胞各個基因的表達量分別為1,得到其它細胞各個基因相對于MDA-MB-436細胞的表達倍數(shù),與實時熒光定量PCR的結果比對,判斷基因芯片檢測結果的可靠
3、性;挑選感興趣的基因,合成特異性敲低基因的siRNA,將siRNA瞬時轉染進表達豐度較高的細胞內,準備兩份轉入 siRNA的細胞,一份用來統(tǒng)計cell-in-cell的形成率;另一份提取mRNA,實時熒光定量該敲低基因的表達效率。第一輪篩選出能夠調節(jié)細胞cell-in-cell形成的表達量被敲低的基因。第二輪在多個細胞系中敲低選定基因的表達,檢驗該基因調節(jié)細胞cell-in-cell形成的是否具有普遍性。構建候選基因的過表達病毒載體,包
4、裝病毒,將病毒感染進入細胞,加入抗生素篩選具有抗性的細胞系,檢測基因的過表達對細胞cell-in-cell形成的調控作用。
結果:利用基因芯片技術篩選出66個表達差異在2倍以上的基因;檢驗了15個基因在細胞中的相對表達量,其中14個基因的相對表達量與芯片分析結果一致;初步篩選,以cell-in-cell形成率低的MDA-MB-436細胞為參照共篩選出兩類基因:上調基因和下調基因,其中2個上調基因,分別為 NUPR1基因和PCD
5、H7基因;4個下調基因分別為Myosin1b基因,RBP1基因,IL-8基因和WIPF3基因。基因在多細胞中驗證顯示:敲低Myosin1b基因表達能夠抑制MDA-MB-436細胞,F(xiàn)細胞,MCF7細胞cell-in-cell結構的形成;敲低PCDH7基因的表達能夠促進MDA-MB-436,MDA-MB-436-18,F(xiàn)細胞cell-in-cell結構的形成。在構建PCDH7過表達載體的過程中,我們發(fā)現(xiàn)了不同于NCBI數(shù)據(jù)庫報道PCDH7
6、基因的四個轉錄本以外的第5個轉錄本,分別將PCDH7的5個轉錄本在MCF10A細胞中過表達,發(fā)現(xiàn)a和b轉錄本對MCF10A細胞cell-in-cell形成無顯著影響,而過表達PCDH7基因的c、d、e轉錄本能夠顯著抑制MCF10A細胞cell-in-cell的形成,其形成率由對照的23%降至10%左右。
結論:篩選出兩類調控cell-in-cell形成的基因,即與cell-in-cell結構形成負相關的基因,分別為NUPR1基
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