PCDH7作為cell-in-cell結(jié)構(gòu)形成調(diào)控分子的篩選與研究.pdf

1、目的：篩選調(diào)控腫瘤細(xì)胞 cell-in-cell結(jié)構(gòu)形成的基因，并研究基因調(diào)節(jié)cell-in-cell結(jié)構(gòu)形成的機(jī)制。
　　內(nèi)容和方法：我們?nèi)⊥N組織不同來(lái)源的乳腺瘤細(xì)胞，給以相同的培養(yǎng)條件，懸浮相同數(shù)量的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞cell-in-cell形成率；收集同等量腫瘤細(xì)胞Trizol裂解液,均分為兩份，將其中的一份樣品委托公司使用基因芯片技術(shù)采集細(xì)胞樣品中各個(gè)基因的熒光信號(hào)；借助軟件分析，可聚類

2、分析出不同樣品之間表達(dá)差異的基因，將基因歸類并挑選出部分基因，設(shè)計(jì)針對(duì)每個(gè)基因的qPCR引物,提取另一份細(xì)胞樣品的mRNA，以同等量的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，再以cDNA為模板，分別擴(kuò)增各個(gè)基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀精確得到樣品各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量；選取MDA-MB-436細(xì)胞各個(gè)基因的表達(dá)量分別為1，得到其它細(xì)胞各個(gè)基因相對(duì)于MDA-MB-436細(xì)胞的表達(dá)倍數(shù)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果比對(duì)，判斷基因芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠

3、性；挑選感興趣的基因，合成特異性敲低基因的siRNA，將siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)表達(dá)豐度較高的細(xì)胞內(nèi)，準(zhǔn)備兩份轉(zhuǎn)入 siRNA的細(xì)胞，一份用來(lái)統(tǒng)計(jì)cell-in-cell的形成率；另一份提取mRNA，實(shí)時(shí)熒光定量該敲低基因的表達(dá)效率。第一輪篩選出能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞cell-in-cell形成的表達(dá)量被敲低的基因。第二輪在多個(gè)細(xì)胞系中敲低選定基因的表達(dá)，檢驗(yàn)該基因調(diào)節(jié)細(xì)胞cell-in-cell形成的是否具有普遍性。構(gòu)建候選基因的過(guò)表達(dá)病毒載體，包

4、裝病毒，將病毒感染進(jìn)入細(xì)胞，加入抗生素篩選具有抗性的細(xì)胞系，檢測(cè)基因的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞cell-in-cell形成的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：利用基因芯片技術(shù)篩選出66個(gè)表達(dá)差異在2倍以上的基因；檢驗(yàn)了15個(gè)基因在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，其中14個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與芯片分析結(jié)果一致；初步篩選，以cell-in-cell形成率低的MDA-MB-436細(xì)胞為參照共篩選出兩類基因：上調(diào)基因和下調(diào)基因，其中2個(gè)上調(diào)基因，分別為 NUPR1基因和PCD

5、H7基因；4個(gè)下調(diào)基因分別為Myosin1b基因，RBP1基因，IL-8基因和WIPF3基因?；蛟诙嗉?xì)胞中驗(yàn)證顯示：敲低Myosin1b基因表達(dá)能夠抑制MDA-MB-436細(xì)胞，F(xiàn)細(xì)胞，MCF7細(xì)胞cell-in-cell結(jié)構(gòu)的形成；敲低PCDH7基因的表達(dá)能夠促進(jìn)MDA-MB-436,MDA-MB-436-18，F(xiàn)細(xì)胞cell-in-cell結(jié)構(gòu)的形成。在構(gòu)建PCDH7過(guò)表達(dá)載體的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)了不同于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道PCDH7

6、基因的四個(gè)轉(zhuǎn)錄本以外的第5個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別將PCDH7的5個(gè)轉(zhuǎn)錄本在MCF10A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)a和b轉(zhuǎn)錄本對(duì)MCF10A細(xì)胞cell-in-cell形成無(wú)顯著影響，而過(guò)表達(dá)PCDH7基因的c、d、e轉(zhuǎn)錄本能夠顯著抑制MCF10A細(xì)胞cell-in-cell的形成，其形成率由對(duì)照的23％降至10%左右。
　　結(jié)論：篩選出兩類調(diào)控cell-in-cell形成的基因，即與cell-in-cell結(jié)構(gòu)形成負(fù)相關(guān)的基因，分別為NUPR1基