應(yīng)用CELL-SELEX篩選PANC-1細胞適配體技術(shù)研究.pdf

1、細胞適配體篩選可概括為前期準備、PCR擴增、次級文庫制備和篩選四個部分，本文以這四個內(nèi)容為導(dǎo)向，對CELL-SELEX技術(shù)篩選細胞適配體方法學(xué)進行了深入研究。
　　本文首次以人胰腺癌細胞PANC-1為靶細胞進行適配體篩選研究。在對照細胞選擇上引入了一種新的對照細胞選擇策略，并確定了A549細胞為對照細胞的反向篩選。細胞狀態(tài)穩(wěn)定對適配體篩選非常重要，本文通過高傳代頻率的培養(yǎng)策略來維持細胞在整個篩選過程中狀態(tài)穩(wěn)定。結(jié)合軟件與PCR擴增

2、協(xié)同分析，對引物序列、PCR擴增效率和抗干擾性進行考察，確定了本文所用引物在細胞適配體篩選中的適用性。
　　PCR在CELL-SELEX中被廣范用于擴增次級文庫。隨機文庫為模板的PCR難度大，不確定因素多。本文采用多種PCR方法對隨機文庫PCR特點進行考察。發(fā)現(xiàn)退火溫度調(diào)節(jié)對擴增效率影響明顯，對非特異性擴增作用較??；隨機文庫PCR對程序循環(huán)數(shù)極其敏感，循環(huán)數(shù)遠少于常規(guī)PCR，對擴增效率和選擇性影響較大。在次級文庫PCR方法優(yōu)化中，

3、總結(jié)出一套具有廣泛適用性的PCR優(yōu)化策略，對細胞適配體篩選次級文庫PCR具有指導(dǎo)意義。
　　在次級文庫制備中，針對單鏈分離過程建立了相應(yīng)的監(jiān)控辦法，可對過程及時反饋，并確定待回收樣品。通過延長PCR產(chǎn)物與Streptavidin-Agarose孵育時間，提高了分離柱對PCR產(chǎn)物的固載效率。借助核酸助沉劑（Acryl carrier），建立了適用于適配體篩選ssDNA乙醇低溫沉淀回收方法，可以選擇性回收目的ssDAN，回收率在80.

4、0％以上。同時解決了ssDNA脫鹽、PH平衡和ssDNA濃縮的問題。并建立了相應(yīng)的定量表征方法。
　　篩選是CELL-SELEX的主要內(nèi)容，本文對細胞適配體篩選與篩選強度調(diào)整方法進行了研究。確定了5種基本篩選強度調(diào)整方式（細胞數(shù)量、ssDNA孵育濃度、孵育時間、孵育搖床轉(zhuǎn)速和孵育后洗滌），發(fā)現(xiàn)5種調(diào)整方式之間的協(xié)同關(guān)系，確定了細胞量與文庫孵育濃度在篩選強度調(diào)節(jié)中的基礎(chǔ)地位，以及孵育后洗滌條件中洗滌時間在洗滌強度中的決定性作用。