生物信息挖掘新基因預(yù)測(cè)平臺(tái)的建立與TSEG-3的克隆和功能初步研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：依據(jù)最新生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，充分挖掘現(xiàn)有生物數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)蘊(yùn)含信息，建立基于生物信息和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的新基因克隆和功能預(yù)測(cè)平臺(tái)。
　　 方法：首先，通過(guò)檢索詞從dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，下載研究相關(guān)目標(biāo)序列，將所選序列進(jìn)行Blast分析，比對(duì)出相應(yīng)的Unigene同源簇，下載上述同源簇或通過(guò)數(shù)字差異顯示工具NCBI_DDD檢索組織特異性Unigene同源簇；其次，通過(guò)Biolign軟件進(jìn)行EST c

2、lusters的拼接、延伸和組裝，應(yīng)用Blast檢索程序進(jìn)行EST clusters拼接的contigs序列基因組相似性分析，校正contigs組裝產(chǎn)生的誤差；第三，應(yīng)用Genscan程序分析基因組同源序列的編碼區(qū)(CDS)；第四，DNAssist 預(yù)測(cè)上述CDS序列的開放閱讀框(open reading frame, ORF)；最后，Premier 5.0設(shè)計(jì)針對(duì)每個(gè)ORF的對(duì)應(yīng)引物。
　　 結(jié)果：通過(guò)數(shù)字差異顯示工具分析RI

3、KEN full-length enriched mouse cDNA library和Epididymis cDNA library間的表達(dá)序列標(biāo)簽的差異序列，得到一個(gè)在RIKEN full-length enriched mouse cDNA library高豐度表達(dá)的同源簇Mm.5168，下載其對(duì)應(yīng)的同源簇為UGID:258077；進(jìn)行后續(xù)EST組裝、延伸和contigs序列校對(duì)，同時(shí)預(yù)測(cè)基因組同源性編碼區(qū)和開放閱讀框，并設(shè)計(jì)相應(yīng)

4、的引物。
　　 結(jié)論：生物信息數(shù)據(jù)挖掘新基因克隆和功能預(yù)測(cè)平臺(tái)能有效的發(fā)現(xiàn)組織特異性Unigene同源簇，為未知新基因的克隆和功能預(yù)測(cè)提供了很好的方向。
　　 第二部分
　　 目的：應(yīng)用生物信息數(shù)據(jù)挖掘新基因克隆和功能預(yù)測(cè)平臺(tái)，預(yù)測(cè)可能參與睪丸精子發(fā)生和男性不育相關(guān)睪丸基因，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。
　　 方法：首先，利用數(shù)字差異顯示工具DigitAlDifferentiAlDisplay檢索與EST

5、片段BY706707.1的同源簇，按前文提出的生物信息數(shù)據(jù)挖掘新基因克隆和功能預(yù)測(cè)流程，預(yù)測(cè)出一個(gè)新的編碼區(qū)序列；其次，通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證，證實(shí)其確實(shí)存在于成年小鼠睪丸；第三，通過(guò)T/A克隆，進(jìn)行測(cè)序分析其與設(shè)計(jì)序列的一致性和同源性，驗(yàn)證了新基因預(yù)測(cè)平臺(tái)的可靠程度；通過(guò)原位雜交分析分析TSEG-3表達(dá)的細(xì)胞類型，同時(shí)以用Northern blotting分析轉(zhuǎn)錄本大小和RT-PCR分析TSEG-3多器官和不同發(fā)育階段表達(dá)譜序列。

6、>　　 結(jié)果：成功從小鼠睪丸組織中擴(kuò)增出TSEG-3，測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，將基因序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得Genbank登錄號(hào)：EU477370(GI:186892498)，命名為睪丸特異表達(dá)基因3(TSEG-3)。原位雜交結(jié)果顯示TSEG-3表達(dá)于精原細(xì)胞、少量精母細(xì)胞和精子細(xì)胞等，Northern Blotting印跡證實(shí)轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度為1023bp左右，小鼠TSEG-3多組織表達(dá)譜分析顯示TSEG-3特異地表達(dá)于睪丸組織，

7、在出生后2月齡時(shí)達(dá)到表達(dá)峰值。
　　 結(jié)論：TSEG-3是睪丸特異性表達(dá)基因，具有發(fā)育階段特異性特征，可能參與小鼠生精過(guò)程，深入研究TSEG-3的功能有助于闡明精子發(fā)生機(jī)制和男性不育機(jī)制。
　　 第三部分
　　 目的：應(yīng)用生物信息數(shù)據(jù)挖掘工具，進(jìn)行TSEG-3蛋白生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究TSEG-3蛋白的功能提供必要方向。
　　 方法：應(yīng)用序列信息挖掘軟件，分析TSEG-3蛋白質(zhì)物理特性、疏水區(qū)域和親

8、水區(qū)、跨膜區(qū)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、拓樸樹分析、特異性磷酸化位點(diǎn)、抗原位點(diǎn)及肽段、亞細(xì)胞定位及TSEG-3蛋白功能注釋；設(shè)計(jì)TSEG-3抗原多肽并合成多肽，制備抗TSEG-3蛋白血清，Western Blotting鑒定TSEG-3蛋白分子量大小。
　　 結(jié)果：通過(guò)序列分析顯示TSEG-3位于第17號(hào)染色體17A3.3區(qū)，有六個(gè)外顯子組成。TSEG-3屬于DFU634家族基因，在TSEG-3的5'側(cè)翼區(qū)域有六個(gè)啟動(dòng)子序

9、列；miRNA檢索發(fā)現(xiàn)16個(gè)可能相關(guān)miRNA；并在TSEG-3第277AA-285AA預(yù)測(cè)出一個(gè)非穩(wěn)定區(qū)段（disordered regions）序列為：QSLHEALFG；TSEG-3屬于非跨膜蛋白，47.8％可能胞質(zhì)的; 21.7％定位于細(xì)胞核；理論等電點(diǎn)為7.15. 吸光系數(shù)為23680；具有10個(gè)絲氨酸(Serine)位點(diǎn)，3個(gè)酪氨酸(Tyrosine)位點(diǎn)，在第211到221間存在一個(gè)PKC位點(diǎn)，第28氨基酸殘基處為信號(hào)肽區(qū)

10、，第65個(gè)氨基酸為一個(gè)精氨酸/賴氨酸前肽切割位點(diǎn)(Arg(R)/Lys(K))等；TSEG-3蛋白預(yù)測(cè)理論分子量為38,52976KD和Western Blotting檢測(cè)結(jié)果一致；功能預(yù)測(cè)提示TSEG-3可能參與生殖細(xì)胞的分化和凋亡。
　　 結(jié)論：生物信息數(shù)據(jù)挖掘工具為新基因TSEG-3功能研究提供了豐富的研究?jī)?nèi)容，極大減少了TSEG-3功能研究的盲目性，加快了基因功能鑒定的速度。
　　 第四部分
　　 目的：

11、探討TSEG-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠精母細(xì)胞系GC-2 spd(ts)的增殖和凋亡的影響。
　　 方法：通過(guò)構(gòu)建pEGFP-TSEG-3載體和體外培養(yǎng)小鼠精母細(xì)胞系GC-2 spd(ts)，觀察融合蛋白EGFP-TSEG-3的亞細(xì)胞定位；采用MTT法檢測(cè) TSEG-3過(guò)表達(dá)對(duì)GC-2 spd(ts)細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析TSEG-3過(guò)表達(dá)對(duì)GC-2 spd(ts)細(xì)胞周期的作用；AO/EB雙重染色法、Hoechst 3325

12、8/PI雙染、Annexin V/PI雙染法和JC-1染色分析TSEG-3過(guò)表達(dá)對(duì)GC-2 spd(ts)細(xì)胞凋亡率的影響；Real-Time RT-PCR分析TSEG-3過(guò)表達(dá)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響。
　　 結(jié)果：融合蛋白EGFP-TSEG-3定位于細(xì)胞核，MTT法結(jié)果提示TSEG-3過(guò)表達(dá)抑制GC-2 spd(ts)細(xì)胞增殖；TSEG-3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)GC-2 spd(ts)細(xì)胞出現(xiàn)G1和G2/ M期捕獲。TSEG-3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)G

13、C-2 spd(ts)細(xì)胞凋亡，Real-Time RT-PCR顯示TSEG-3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)Fas上調(diào)，同時(shí)Bcl-2/Bax比率下調(diào)，說(shuō)明Fas/Fas通路和Bcl-2/Bax均參與TSEG-3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)GC-2 spd(ts)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：TSEG-3過(guò)表達(dá)抑制GC-2 spd(ts)細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)GC-2 spd(ts)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as/Fas通路和Bcl-2/Bax均參與TSEG-3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)GC-2 spd(t

14、s)細(xì)胞凋亡途徑。
　　 第五部分
　　 目的：整體水平探討TSEG-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠睪丸精原細(xì)胞的影響，并分析其在睪丸疾病模型表達(dá)譜。
　　 方法：制備in vivo-jetPEI?-pEGFP-TSEG-3聚合物，構(gòu)建TSEG-3過(guò)表達(dá)模型，HE染色和Tunel分析TSEG-3過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠生殖細(xì)胞的影響；同時(shí)構(gòu)建手術(shù)隱睪模型，分析TSEG-3轉(zhuǎn)錄水平與細(xì)胞凋亡率的關(guān)系，分析溫度對(duì)TSEG-3轉(zhuǎn)錄水平的影響；復(fù)制

15、17β雌二醇誘導(dǎo)隱睪模型，檢測(cè)17β雌二醇誘導(dǎo)隱睪模型中TSEG-3轉(zhuǎn)錄水平，明確17β雌二醇對(duì)TSEG-3轉(zhuǎn)錄的影響。
　　 結(jié)果：熒光顯微鏡觀察提示In Vivo JetPEITM是一種高效、可靠安全的DNA轉(zhuǎn)染試劑，能有效的攜帶外源DNA入生殖細(xì)胞。TSEG-3過(guò)表達(dá)使睪丸組織生精小管官腔內(nèi)細(xì)胞密度減少，生精小管官腔變薄，大量精原細(xì)胞及精母細(xì)胞缺失，未發(fā)現(xiàn)成熟精子。Tunel結(jié)果提示TSEG-3過(guò)表達(dá)可能誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡