牛奶中多種抗生素的懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、食品安全問題是關(guān)系民生的重大問題，關(guān)系到每一個(gè)公民的身體健康和生命安全，也是中國(guó)政府一直以來非常關(guān)心的問題之一。其中，乳制品已經(jīng)成為我國(guó)居民日常消費(fèi)的重要食品之一，乳制品的安全問題也日益受到關(guān)注。在乳制品中，除了三聚氰胺等非法添加劑之外，抗生素殘留是其中危害較大的污染物。為解決現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)達(dá)不到對(duì)多種抗生素殘留快速、靈敏和高通量的檢測(cè)的問題，本研究建立了一種新型多種抗生素殘留的高通量懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)和方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶中的抗生素快速、準(zhǔn)

2、確、和高效的定量檢測(cè)
　　 本研究以五種常用于奶牛疾病治療的抗生素(氯霉素、四環(huán)素、慶大霉素、鏈霉素和泰樂菌素)為靶標(biāo)物，基于間接競(jìng)爭(zhēng)法的免疫學(xué)檢測(cè)原理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)五種抗生素殘留靶標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)的目標(biāo)；通過一系列的優(yōu)化和篩選實(shí)驗(yàn)條件，使懸浮芯片檢測(cè)的靈敏度、信號(hào)強(qiáng)度、穩(wěn)定性都有了進(jìn)一步的提高，同時(shí)還降低了檢測(cè)成本；探索并成功應(yīng)用了一種新的、適用于懸浮芯片檢測(cè)的牛奶樣品前處理技術(shù)，該技術(shù)處理快速，操作簡(jiǎn)單，對(duì)待測(cè)靶標(biāo)物幾乎沒有影響，處

3、理之后的樣品對(duì)懸浮芯片檢測(cè)的靈敏度、穩(wěn)定性等方面沒有負(fù)面影響；通過比對(duì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定了懸浮芯片法檢測(cè)的準(zhǔn)確性，與常規(guī)檢測(cè)方法相比，懸浮芯片法檢測(cè)簡(jiǎn)便、快捷，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
　　 本研究的研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾方面：
　　 1.不同抗生素抗原分子在微球上的包被偶聯(lián)技術(shù)的研究采用戊二醛法和碳二亞胺法成功合成了部分抗生素的蛋白結(jié)合物；通過比較不同的包被濃度下所獲得的報(bào)告熒光值，最終確定最佳的抗原包被量，利用EDC和

4、NHS將不同的抗原偶聯(lián)到微球上。
　　 2.Luminex懸浮芯片系統(tǒng)反應(yīng)條件的選擇與優(yōu)化對(duì)反應(yīng)緩沖液的離子強(qiáng)度、反應(yīng)緩沖液的類型、懸浮芯片檢測(cè)反應(yīng)方式、最佳抗原抗體反應(yīng)時(shí)間、試劑加入方式、抗體加入量和SA-PE稀釋比例以及多通道檢測(cè)時(shí)抗體使用量等檢測(cè)條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化。
　　 3.Luminex懸浮芯片系統(tǒng)對(duì)各種抗生素的同時(shí)檢測(cè)與分析，包括各種抗生素的檢測(cè)靈敏度、特異性測(cè)定以及方法的比對(duì)實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化條件、摸索各種待測(cè)靶

5、標(biāo)物的濃度梯度，繪制出五種抗生素的單通道檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在多通道檢測(cè)抗體使用量?jī)?yōu)化的基礎(chǔ)上，繪制出了五種抗生素的多通道檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Logistic回歸對(duì)曲線進(jìn)行擬合，曲線關(guān)系良好，決定系數(shù)R2>0.9945，靈敏度與國(guó)標(biāo)方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　 通過懸浮芯片檢測(cè)的特異性實(shí)驗(yàn)，證明了五種懸浮芯片微球與其對(duì)應(yīng)的抗原之間可準(zhǔn)確地相互識(shí)別；對(duì)于這五種抗生素的結(jié)構(gòu)類似物的檢測(cè)，除了對(duì)兩種四環(huán)素類藥物有一定的交叉反應(yīng)，其余特異性

6、良好，與多種藥物均無交叉和干擾反應(yīng)。
　　 采用傳統(tǒng)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和液相色譜法檢測(cè)各種抗生素殘留，與懸浮芯片法進(jìn)行比對(duì)研究，結(jié)果表明懸浮芯片法檢測(cè)的靈敏度比這兩種傳統(tǒng)方法高，而且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速(包括樣品前處理，整個(gè)檢測(cè)過程不超過2 h)和高通量的優(yōu)勢(shì)是這兩種方法所不能比擬的。
　　 4.用于懸浮芯片檢測(cè)的牛奶樣品的前處理技術(shù)研究
　　 通過比較不同的處理方法，探索出了一種新的，適用于懸浮芯片技術(shù)的牛奶

7、樣品前處理方法。該方法簡(jiǎn)單，快速，有效，使得檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性都有了較大的提高，為以后應(yīng)用于其他食品的檢測(cè)提供了思路。整個(gè)前處理過程可以在20分鐘內(nèi)完成?？瞻准訕?biāo)回收實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品的檢測(cè)也證明，這種樣品前處理方法效果良好，對(duì)待測(cè)靶標(biāo)物和免疫反應(yīng)影響小，完全可以用于懸浮芯片檢測(cè)的樣品前處理。
　　 5.Luminex懸浮芯片系統(tǒng)對(duì)牛奶實(shí)際樣品的檢測(cè)
　　 對(duì)經(jīng)過前處理的牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，計(jì)算其中抗生素的含

8、量。通過和同一樣品的ELISA檢測(cè)結(jié)果相比較，懸浮芯片檢測(cè)的精確度較高，誤差較小。
　　 五種抗生素的懸浮芯片實(shí)際樣品檢測(cè)范圍分別為：泰樂菌素0.026～400ng/mL，慶大霉素0.4～25.6 ng/mL，四環(huán)素0.05～781.25 ng/mL，鏈霉素0.08～1250 ng/mL，氯霉素0.5～7812.5 ng/mL。
　　 懸浮芯片技術(shù)在國(guó)內(nèi)外多應(yīng)用于對(duì)蛋白質(zhì)和核酸等大分子的檢測(cè)，對(duì)牛奶中不同類型的抗生素的檢