高產(chǎn)雷帕霉素吸水鏈霉菌的遺傳改造和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化.pdf

1、雷帕霉素（Rapamycin）又名西羅莫司（Sirolimus），是由吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)產(chǎn)生的新型三烯含氮大環(huán)內(nèi)酯抗生素。雷帕霉素除作為免疫抑制劑外，目前還廣泛應(yīng)用于器官移植、皮膚病、心臟病等領(lǐng)域。本文以實(shí)驗(yàn)室保存的低產(chǎn)雷帕霉素產(chǎn)生菌為出發(fā)菌株，通過(guò)傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)，結(jié)合高通量篩選手段，輔以培養(yǎng)基優(yōu)化，大幅度提高了雷帕霉素產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力，并在發(fā)酵罐進(jìn)行了中試及放大。同時(shí)，采用原生質(zhì)體育種及基因組重排等新技術(shù)對(duì)

2、雷帕霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行選育，并初步探索了雷帕霉素的異源合成。
　　 試驗(yàn)首先初步優(yōu)化了雷帕霉素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，確定了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為：4％葡萄糖，1%甘油，1%黃豆餅粉，0.15%L-Lys，0.5%K2HPO4，0.5%KH2PO4，0.5%氯化鈉，0.2%硫酸鎂，0.15%硫酸亞鐵。較優(yōu)的搖瓶發(fā)酵條件是：搖瓶裝液量為20ml/250ml，培養(yǎng)溫度為28℃，接種后培養(yǎng)5天收獲菌體。在以上最優(yōu)條件下，原始菌株發(fā)酵液中雷帕

3、霉素產(chǎn)量最高可達(dá)120mg/L.
　　 為提高雷帕霉素產(chǎn)量，開(kāi)展了雷帕霉素產(chǎn)生菌的誘變育種研究。首先考察了紫外線、DES、NTG等不同誘變劑的劑量效應(yīng)。然后通過(guò)單一誘變劑連續(xù)誘變、不同誘變劑交替誘變、不同誘變劑連續(xù)誘變等多種誘變方式，篩選到產(chǎn)量為279mg/L的誘變菌株D7-804，比出發(fā)菌株提高了156%。進(jìn)一步發(fā)展了基于96孔板培養(yǎng)的雷帕霉素突變株的高通量篩選新技術(shù)，通過(guò)對(duì)約100，000個(gè)單菌落的快速高效篩選，篩選到高產(chǎn)突

4、變菌株N5632，其最高產(chǎn)量達(dá)到445mg/L。
　　 在以上高產(chǎn)菌選育和搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了在120L發(fā)酵罐上的雷帕霉素發(fā)酵的放大研究。結(jié)果表明，初始攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為200rpm，在進(jìn)入產(chǎn)物合成期后轉(zhuǎn)速升至400rpm，控制整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中溶氧不低于10%，雷帕霉素產(chǎn)量最高達(dá)到412mg/L，基本達(dá)到了搖瓶發(fā)酵的平均水平。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展了采用多種補(bǔ)料方式提高發(fā)酵水平的研究。結(jié)果表明，40h為最佳補(bǔ)料時(shí)間，采用多組分組合補(bǔ)

5、料方式能夠最大幅度提高發(fā)酵水平，其中組合補(bǔ)料甘油與磷酸鹽的方式，不僅能夠保持發(fā)酵液的pH值的相對(duì)穩(wěn)定，而且能有效提高雷帕霉素產(chǎn)量，發(fā)酵水平最高可達(dá)800mg/L以上。最后，將這一新型補(bǔ)料發(fā)酵工藝在20噸發(fā)酵罐上進(jìn)行工業(yè)放大，雷帕霉素發(fā)酵水平也達(dá)到了700mg/L，產(chǎn)量較本課題開(kāi)始時(shí)的最初發(fā)酵水平提高了4倍以上。
　　 為了最大程度地提高雷帕霉素高產(chǎn)菌選育的效率，開(kāi)展了基因組重排技術(shù)改造吸水鏈霉菌的遺傳性能，提高雷帕菌素發(fā)酵水平的

6、研究。首先確定了雷帕霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備、再生和融合的較優(yōu)條件；然后通過(guò)吸水鏈霉菌原生質(zhì)體誘變、融合以及與紅霉素生產(chǎn)菌原生質(zhì)體的種間融合等技術(shù)，得到具有不同遺傳特性的產(chǎn)雷帕菌素產(chǎn)量較高的突變株。最后，對(duì)7株雷帕霉素高產(chǎn)突變株進(jìn)行一輪基因組重排育種，結(jié)果篩選到一株產(chǎn)量較高菌株(GS-1437)，雷帕霉素產(chǎn)量達(dá)到445mg/L，比最初出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了59.5%，充分顯示了基因組重排技術(shù)在改造鏈霉菌遺傳特性方面的巨大潛力，與傳統(tǒng)誘變育種方

7、法比較，具有快速高效等顯著優(yōu)點(diǎn)。。
　　 開(kāi)展了雷帕霉素生物合成基因鏃在異源宿主菌中表達(dá)及生物合成雷帕霉素的研究。在已構(gòu)建的三種雷帕霉素異源合成系統(tǒng)中，白色鏈霉菌S. albus28-1-1發(fā)酵產(chǎn)物樣品表現(xiàn)出與雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)品類(lèi)似的抗菌生物活性。通過(guò)初步的結(jié)構(gòu)鑒定和分析，該發(fā)酵產(chǎn)物樣品中的未知生物活性物質(zhì)是一種生物活性類(lèi)似雷帕霉素但結(jié)構(gòu)上有較大區(qū)別的新化合物。進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)異源宿主菌中雷帕霉素生物合成基因鏃中的各個(gè)基因進(jìn)行了