利迪鏈霉菌A02高產(chǎn)納他霉素工程菌的選育.pdf

1、利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02是北京市農(nóng)林科學(xué)院從京郊菜園泥土中篩選到的一株放線菌，研究發(fā)現(xiàn)該菌株對多種病原真菌均有較強抑菌活性，進一步分離鑒定表明，該菌株能夠合成多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素納他霉素。為提高菌株納他霉素產(chǎn)量使其更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害防治中，本課題對利迪鏈霉菌A02進行以下三方面的研究:一是采用基因工程手段使透明顫菌血紅蛋白(VHb）基因在利迪鏈霉菌A02中得到表達，并研究其對生長代謝的影響;二是對工

2、程菌株AV02的發(fā)酵條件進行初步優(yōu)化;三是應(yīng)用基因工程技術(shù)對利迪鏈霉菌A02次級代謝調(diào)控中的負(fù)調(diào)控基因進行敲除，并研究其對出發(fā)菌株納他霉素合成的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)以整合有鏈霉菌組成型表達的強紅霉素抗性基因啟動子的表達載體pIB139為出發(fā)質(zhì)粒，將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)克隆到pIB139質(zhì)粒，然后通過接合轉(zhuǎn)移的方式將整合載體pIB 139-vgb轉(zhuǎn)入利迪鏈霉菌(S.lydicus)A02，經(jīng)過抗性篩選和PC

3、R驗證，得到利迪鏈霉菌A02VHb基因表達菌株AV02。采用不同裝瓶量搖瓶發(fā)酵，結(jié)果表明:vgb表達可促進菌體的生長和次級代謝產(chǎn)物的合成。HPLC檢測發(fā)酵液中納他霉素產(chǎn)量比原始菌株提高84％。
　　(2)通過對工程菌株AV02的搖瓶發(fā)酵實驗，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件:種齡26-30h、培養(yǎng)溫度28℃、發(fā)酵初始pH值7.0、裝液量10％、接種量6％、轉(zhuǎn)速220rpm。并在此培養(yǎng)條件下向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為0.2％的碳酸鈣，0.05％