產(chǎn)綠孢子阿維鏈霉菌的遺傳改造和發(fā)酵條件的研究.pdf

1、阿維菌素(avermectins)是由阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯齊墩果糖雙糖衍生物，由8個(gè)組分組成，具有高效、低毒、廣譜的特點(diǎn)。其中阿維菌素B1的殺蟲活性最強(qiáng)，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)上具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。 將aveD基因缺失載體pCZ8(pKC1139：：△aveD)轉(zhuǎn)化到產(chǎn)綠孢子的阿維鏈霉菌UA-G中，通過同源雙交換得到aveD基因的缺失突變株

2、GB-165。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵和HPLC檢測(cè)，該突變株只產(chǎn)阿維菌素B組分。缺失突變株的阿維菌素的總產(chǎn)量與出發(fā)菌株的總產(chǎn)量基本相同，而且缺失突變株中阿維菌素B2組分的產(chǎn)量提高顯著，但阿維菌素B1組分的產(chǎn)量略有提高。該突變株的性狀和產(chǎn)量都很穩(wěn)定。 以aveD基因的缺失突變株GB-165為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵條件的研究。結(jié)果表明，有機(jī)氮源以花生蛋白粉和棉籽蛋白為混合氮源最佳，碳源以可溶性淀粉和麥芽糖為混合碳源最佳。而測(cè)試的無機(jī)氮源中，(

3、NH4)2SO4和NH4NO3在低濃度下對(duì)抗生素的合成均有一定促進(jìn)作用，其中以(NH4)2SO4的作用最為明顯，其濃度在0.1g/L為最佳。同時(shí)研究了無機(jī)鹽和微量元素對(duì)于發(fā)酵的影響，最終確定了培養(yǎng)基中各種無機(jī)鹽和微量元素含量分別為KCl3g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L、K2HPO4·3H2O0.3g/L、CoCl2·6H2O7.5mg/L、CaCO31g/L、ZnSO4·7H2O2mg/L。通過正交試驗(yàn)確定有機(jī)碳、氮源的最佳水

4、平分別為可溶性淀粉95g/L、麥芽糖3g/L、花生蛋白粉25g/L、棉籽蛋白7g/L，其發(fā)酵單位達(dá)到3277.15μg/mL，比原來提高63％。 PCR擴(kuò)增了1.3kb編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的阿維鏈霉菌metK基因，將其分別克隆到含有紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子(ermE*p)的多拷貝和整合型表達(dá)載體中，將構(gòu)建好的整合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于菌株GB-165中，搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明阿維菌素的產(chǎn)量提高了54％-76％。而多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到阿維鏈霉菌的