始旋鏈霉菌基因組重排育種、普那霉素發(fā)酵條件優(yōu)化及高產(chǎn)機理的分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、普那霉素(pristinamycin)是由始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)產(chǎn)生的一種鏈陽性菌素類(Streptogramin)抗生素,包含普那霉素I(PI)和普那霉素II(PII)兩類化合物,對大多數(shù)革蘭氏陽性菌,如MRSA、MRSE等均具有較強的殺菌活性,且抗生素后效應較長,被視為治療頑固性革蘭氏陽性菌感染的特選藥物.目前,普那霉素已經(jīng)在國外實現(xiàn)商品化生產(chǎn),我國還未進行工業(yè)生產(chǎn).因此,作為藥效優(yōu)

2、良的抗生素,對普那霉素進行深入的研究和開發(fā)具有重要意義。
   本論文以提高普那霉素的發(fā)酵水平為目標,對始旋鏈霉菌的基因組重排、高產(chǎn)菌株培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化以及高產(chǎn)菌產(chǎn)物合成分子機理等進行了深入細致的研究,獲得了如下主要研究結果:
   1.以S.pristinaespiralis0957作為原始菌株,利用紫外誘變獲得四株普那霉素產(chǎn)量和耐受性都有所提高的菌株作為基因組重排的出發(fā)菌株。對始旋鏈霉菌原生質體制備和再生過程

3、進行了研究,確定了合適的制備方案為:添加0.6%的甘氨酸到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲,用2%的溶菌酶在32℃下酶解1.5 h。始旋鏈霉菌的原生質體制備率和原生質體再生率分別達到了95.8%和18.1%。
   2.對四株出發(fā)菌株(M-23、M-79、M-113和M-156)連續(xù)以原生質融合的方式進行基因組重排,然后以普那霉素自身耐受性的提高作為篩選依據(jù),獲得了一株高產(chǎn)突變菌株G4-17,它的原生質體對普那霉素耐受性高達100μg/mL

4、,搖瓶培養(yǎng)時普那霉素產(chǎn)量達到0.89 g/L,比產(chǎn)量最高的親本菌株提高了89.4%,比原始出發(fā)菌株提高了145.9%。通過連續(xù)傳代實驗,確定高產(chǎn)菌株G4-17的遺傳穩(wěn)定性良好。
   3.研究了S. pristinaespiralis G4-17菌株的搖瓶發(fā)酵條件,通過正交設計對發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化;考察了搖瓶培養(yǎng)條件對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:可溶性淀粉3.0%、蔗糖1.0%、葡萄糖0.5%、麥芽糖0

5、.8%、黃豆餅粉1.2%、蛋白胨0.4%、魚粉1.2%、酵母粉0.6%、(NH4)2SO40.2%、MgSO40.35%、KH2PO40.02%、CaCO30.4%,NaNO30.075%;優(yōu)化的搖瓶培養(yǎng)條件為:初始pH值為6.5,在25mL/250 mL三角瓶中以6%接種量接入經(jīng)過36 h培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液,在25℃,220 rpm條件下進行培養(yǎng)60 h,S.pristinaespiralis G4-17的普那霉素產(chǎn)量達到了1.21 g

6、/L,比優(yōu)化前的產(chǎn)量(0.89 g/L)提高了40.0%。在5-L發(fā)酵罐上,優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更有利于高產(chǎn)菌種G4-17合成,G4-17在培養(yǎng)60 h時普那霉素產(chǎn)量達到最大值1.237 g/L。
   4.利用ApaI/TaqI雙酶切的AFLP技術對3支篩選出的普那霉素高產(chǎn)菌株以及它們的原始菌株CGMCC0957進行了遺傳多態(tài)性研究.結果顯示,高產(chǎn)菌株間具有類似的AFLP指紋圖譜,相比而言,高產(chǎn)菌株與原始菌株間的AFLP指紋圖譜差

7、異稍大。因此,在這些高產(chǎn)菌株特別是產(chǎn)量水平類似的菌株中存在類似的變異機理導致了普那霉素的產(chǎn)量提高。另外,AFLP分析還表明基因組重排技術較傳統(tǒng)誘變育種更容易使微生物菌株產(chǎn)生基因組水平的變異,因此,利用基因組重排技術進行微生物育種工作較傳統(tǒng)誘變育種技術更為有效。
   5.利用RT-PCR技術檢測了普那霉素生物合成相關基因及其抗性基因在高產(chǎn)菌株G4-17和原始菌株CGMCC0957表達的豐度變化,分析了這些基因表達水平與合成普那霉

8、素的關系。結果顯示PI組分生物合成相關基因snbA在高產(chǎn)菌株的整個發(fā)酵進程中始終保持高豐度表達,而原始菌株只在發(fā)酵前期(24~48 h)高豐度表達,隨后逐漸降低。因此snbA基因的持續(xù)高表達與高產(chǎn)菌株的PI組分高產(chǎn)密切相關。PII組分生物合成基因snaB基因在在這兩個菌株的發(fā)酵過程中表達豐度變化與snbA基因的表達變化類似,表明snaB基因的持續(xù)高表達與高產(chǎn)菌株的PII組分高產(chǎn)密切相關。其它兩個PII組分生物合成基因snaA、snaC在

9、高產(chǎn)菌株和原始菌株的發(fā)酵過程中無明顯差異。研究還發(fā)現(xiàn),對普那霉素產(chǎn)生抗性的ptr基因在高產(chǎn)菌株的整個發(fā)酵進程中表達豐度較高,而在原始菌株中僅在發(fā)酵中后期(48~96 h)保持較高豐度表達。因此,ptr基因在高產(chǎn)菌株開始合成普那霉素之前就已經(jīng)高表達,從而建立起了自我保護性抗性,這種抗性的提前建立與普那霉素高產(chǎn)密切相關。另外,普那霉素生物合成的調控基因spbR在高產(chǎn)菌株和原始菌株發(fā)酵過程中的基因表達豐度沒有顯著變化,表明這個調控基因的表達與

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