始旋鏈霉菌基因組重排育種、普那霉素發(fā)酵條件優(yōu)化及高產(chǎn)機(jī)理的分析.pdf

1、普那霉素(pristinamycin)是由始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)產(chǎn)生的一種鏈陽性菌素類(Streptogramin)抗生素，包含普那霉素I(PI)和普那霉素II(PII)兩類化合物，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌，如MRSA、MRSE等均具有較強(qiáng)的殺菌活性，且抗生素后效應(yīng)較長(zhǎng)，被視為治療頑固性革蘭氏陽性菌感染的特選藥物.目前，普那霉素已經(jīng)在國(guó)外實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，我國(guó)還未進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn).因此，作為藥效優(yōu)

2、良的抗生素，對(duì)普那霉素進(jìn)行深入的研究和開發(fā)具有重要意義。
　　 本論文以提高普那霉素的發(fā)酵水平為目標(biāo)，對(duì)始旋鏈霉菌的基因組重排、高產(chǎn)菌株培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化以及高產(chǎn)菌產(chǎn)物合成分子機(jī)理等進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，獲得了如下主要研究結(jié)果：
　　 1.以S.pristinaespiralis0957作為原始菌株，利用紫外誘變獲得四株普那霉素產(chǎn)量和耐受性都有所提高的菌株作為基因組重排的出發(fā)菌株。對(duì)始旋鏈霉菌原生質(zhì)體制備和再生過程

3、進(jìn)行了研究，確定了合適的制備方案為：添加0.6％的甘氨酸到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲，用2％的溶菌酶在32℃下酶解1.5 h。始旋鏈霉菌的原生質(zhì)體制備率和原生質(zhì)體再生率分別達(dá)到了95.8％和18.1％。
　　 2.對(duì)四株出發(fā)菌株(M-23、M-79、M-113和M-156)連續(xù)以原生質(zhì)融合的方式進(jìn)行基因組重排，然后以普那霉素自身耐受性的提高作為篩選依據(jù)，獲得了一株高產(chǎn)突變菌株G4-17，它的原生質(zhì)體對(duì)普那霉素耐受性高達(dá)100μg/mL

4、，搖瓶培養(yǎng)時(shí)普那霉素產(chǎn)量達(dá)到0.89 g/L，比產(chǎn)量最高的親本菌株提高了89.4％，比原始出發(fā)菌株提高了145.9％。通過連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)，確定高產(chǎn)菌株G4-17的遺傳穩(wěn)定性良好。
　　 3.研究了S. pristinaespiralis G4-17菌株的搖瓶發(fā)酵條件，通過正交設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化；考察了搖瓶培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：可溶性淀粉3.0％、蔗糖1.0％、葡萄糖0.5％、麥芽糖0

5、.8％、黃豆餅粉1.2％、蛋白胨0.4％、魚粉1.2％、酵母粉0.6％、(NH4)2SO40.2％、MgSO40.35％、KH2PO40.02％、CaCO30.4％，NaNO30.075％；優(yōu)化的搖瓶培養(yǎng)條件為：初始pH值為6.5，在25mL/250 mL三角瓶中以6％接種量接入經(jīng)過36 h培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液，在25℃，220 rpm條件下進(jìn)行培養(yǎng)60 h，S.pristinaespiralis G4-17的普那霉素產(chǎn)量達(dá)到了1.21 g

6、/L，比優(yōu)化前的產(chǎn)量(0.89 g/L)提高了40.0％。在5-L發(fā)酵罐上，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更有利于高產(chǎn)菌種G4-17合成，G4-17在培養(yǎng)60 h時(shí)普那霉素產(chǎn)量達(dá)到最大值1.237 g/L。
　　 4.利用ApaI/TaqI雙酶切的AFLP技術(shù)對(duì)3支篩選出的普那霉素高產(chǎn)菌株以及它們的原始菌株CGMCC0957進(jìn)行了遺傳多態(tài)性研究.結(jié)果顯示，高產(chǎn)菌株間具有類似的AFLP指紋圖譜，相比而言，高產(chǎn)菌株與原始菌株間的AFLP指紋圖譜差

7、異稍大。因此，在這些高產(chǎn)菌株特別是產(chǎn)量水平類似的菌株中存在類似的變異機(jī)理導(dǎo)致了普那霉素的產(chǎn)量提高。另外，AFLP分析還表明基因組重排技術(shù)較傳統(tǒng)誘變育種更容易使微生物菌株產(chǎn)生基因組水平的變異，因此，利用基因組重排技術(shù)進(jìn)行微生物育種工作較傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)更為有效。
　　 5.利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了普那霉素生物合成相關(guān)基因及其抗性基因在高產(chǎn)菌株G4-17和原始菌株CGMCC0957表達(dá)的豐度變化，分析了這些基因表達(dá)水平與合成普那霉

8、素的關(guān)系。結(jié)果顯示PI組分生物合成相關(guān)基因snbA在高產(chǎn)菌株的整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中始終保持高豐度表達(dá)，而原始菌株只在發(fā)酵前期(24～48 h)高豐度表達(dá)，隨后逐漸降低。因此snbA基因的持續(xù)高表達(dá)與高產(chǎn)菌株的PI組分高產(chǎn)密切相關(guān)。PII組分生物合成基因snaB基因在在這兩個(gè)菌株的發(fā)酵過程中表達(dá)豐度變化與snbA基因的表達(dá)變化類似，表明snaB基因的持續(xù)高表達(dá)與高產(chǎn)菌株的PII組分高產(chǎn)密切相關(guān)。其它兩個(gè)PII組分生物合成基因snaA、snaC在

9、高產(chǎn)菌株和原始菌株的發(fā)酵過程中無明顯差異。研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)普那霉素產(chǎn)生抗性的ptr基因在高產(chǎn)菌株的整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中表達(dá)豐度較高，而在原始菌株中僅在發(fā)酵中后期(48～96 h)保持較高豐度表達(dá)。因此，ptr基因在高產(chǎn)菌株開始合成普那霉素之前就已經(jīng)高表達(dá)，從而建立起了自我保護(hù)性抗性，這種抗性的提前建立與普那霉素高產(chǎn)密切相關(guān)。另外，普那霉素生物合成的調(diào)控基因spbR在高產(chǎn)菌株和原始菌株發(fā)酵過程中的基因表達(dá)豐度沒有顯著變化，表明這個(gè)調(diào)控基因的表達(dá)與