植物乳桿菌轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶合成功能性低聚糖的研究.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活的改善和全球?qū)κ称钒踩盃I養(yǎng)問題的日益重視，有機(jī)食品、綠色食品、功能食品、保健食品等，已成為世界各國食品工業(yè)新的增長點(diǎn)。功能性低聚糖作為一種新型的功能性食品添加劑，因其獨(dú)有的生理功能及卓越的物化性質(zhì)，備受消費(fèi)者的信賴和追捧。酶的應(yīng)用是功能性低聚糖制備的重要方法。酶法合成功能性低聚糖的關(guān)鍵是生物催化劑—酶制劑。不同來源的酶合成不同產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)和組成的功能性低聚糖。因此，尋找各種高轉(zhuǎn)糖基活性、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、安全性好的酶源，

2、不斷開發(fā)具有更強(qiáng)益生功效的新型低聚糖，一直是功能性低聚糖研究的重點(diǎn)。乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）被公認(rèn)為是安全的(generallyregardedassafe，GRAS)食品級(jí)微生物，其產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶也相應(yīng)地被認(rèn)為是安全的，無需純化即可直接用于酶法合成功能性低聚糖。作為一種優(yōu)質(zhì)的酶源，關(guān)于利用LAB來源β-半乳糖苷酶來合成功能性低聚糖的報(bào)導(dǎo)卻相對(duì)較少，且缺乏系統(tǒng)的研究。
　　本論文從實(shí)驗(yàn)室分離保藏

3、的148株LAB入手，篩選到的一株產(chǎn)高轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的LAB;采用多種色譜分離技術(shù)聯(lián)用，分離純化得到純酶，然后研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)，酶法合成低聚半乳糖(GOS)和異低聚半乳糖(HeOS)的反應(yīng)條件和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)組成，以及這些功能性低聚糖體外增殖腸道益生菌的作用，為其進(jìn)一步的開發(fā)與應(yīng)用提供了必要的工作基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　1.產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶LAB的篩選及其超聲提取條件優(yōu)化
　　采用X-Gal藍(lán)白

4、斑平板初篩，從實(shí)驗(yàn)室分離保藏的148株LAB中得到43株具有β-半乳糖苷酶活性的LAB;薄層層析(TLC)復(fù)篩，得到7株具有較高轉(zhuǎn)糖基活性的β-半乳糖苷酶的LAB;氣相色譜(GC)準(zhǔn)確定量轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物，從中確定一株轉(zhuǎn)糖基活性最高的β-半乳糖苷酶的產(chǎn)出菌株70810，產(chǎn)率達(dá)到39.2％(w/w);菌株70810為實(shí)驗(yàn)室已鑒定LAB，為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。選定L.plantarum70810作為進(jìn)一步的

5、研究對(duì)象，考察了菌懸液濃縮倍數(shù)、超聲功率、提取時(shí)間等因素對(duì)酶活力的影響，并采用正交設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化得到最佳提取條件，即菌懸液濃縮5倍，超聲功率為400W，工作/間歇時(shí)間為15s/10s，提取總時(shí)間為25min。在此條件下，最終酶活力為5.85±0.11U/mL。在優(yōu)化后提取條件下，繪制了L.plantarum70810發(fā)酵產(chǎn)酶曲線，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)酶模式屬于中期合成型，并確定發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間為20h。
　　2.L.plantarum70810β

6、-半乳糖苷酶分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究
　　從L.plantarum70810來源的β-半乳糖苷酶粗酶液出發(fā)，先后經(jīng)過40～65％飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀、SephacrylS-300凝膠層析、Mono-QTM離子交換層析和Superdex200凝膠層析，各步驟分別采用Native-PAGE和SDS-PAGE電泳測(cè)定其純度，最終得到電泳純的β-半乳糖苷酶。該酶是由兩個(gè)亞基(35KDa和72KDa)組成的異源二聚體。酶純化后的比活力為1

7、96U/mg、純化倍數(shù)為50.3倍、回收率為9％。
　　酶學(xué)性質(zhì)研究表明:以oNPG和乳糖為底物，L.plantarum70810來源的β-半乳糖苷酶的最適合溫度分別是60℃和55℃，最適pH均是8.0。該酶在不高于45℃條件下比較穩(wěn)定，其pH穩(wěn)定范圍是6.5～8.0，37℃條件下保溫48h，相對(duì)酶活保持在70％以上。該酶水解oNPG和乳糖的米氏常數(shù)Km分別為0.89±0.05mM和9.88±0.16mM，最大反應(yīng)速率Vmax分別

8、為194±3.0μmoL/min/mg和15.88±0.21μmoL/min/mg。10mM的Ca2+，Zn2+，Mn2+，Al3+和EDTA對(duì)該酶有顯著抑制作用，而Na+，K2+和Mg2+在較低濃度有輕微促進(jìn)作用。乳糖水解產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖對(duì)該酶有輕微抑制作用。
　　3.酶法合成低聚半乳糖及其GC-MS鑒定和條件優(yōu)化
　　采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)的分析手段，對(duì)來源于L.plantarum70810β-半乳糖苷酶酶法合成的

9、GOS產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，共確定9種低聚二糖和3種低聚三糖，主要連接結(jié)構(gòu)為β(1→6)和β(1→3)糖苷鍵。
　　通過對(duì)乳糖濃度、反應(yīng)溫度、體系pH以及酶濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行研究，監(jiān)測(cè)低聚糖合成反應(yīng)的全過程，確定了酶法合成總GOS，及其各主要組分產(chǎn)量的最優(yōu)條件。乳糖濃度和反應(yīng)溫度的變化對(duì)于產(chǎn)物的合成影響較大，為主要的影響條件，而體系pH和酶濃度對(duì)于各產(chǎn)物最高產(chǎn)量的影響不顯著，為次要影響條件。經(jīng)過對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，總產(chǎn)量與各組分產(chǎn)量的最

10、優(yōu)條件一致，為底物濃度400g/L，體系pH7.0，10U/mL的酶濃度，45℃水浴10h?？侴OS產(chǎn)量達(dá)到177.2g/L，在體系中占44.3％(w/v)。其中異乳糖、6'-半乳二糖、6'-GOS和3'-GOS的產(chǎn)量分別是63.2g/L、15.3g/L、72.2g/L和25.1g/L。
　　利用廉價(jià)的乳清粉代替乳糖，并采用原位合成的工藝酶法合成GOS，其最高產(chǎn)量在18h達(dá)到最高，約為32.05％(w/w)。在組成和結(jié)構(gòu)上，該GO

11、S混合物與以純?nèi)樘菫榈孜锖铣傻腉OS基本一致。
　　4.酶法合成異低聚半乳糖及其分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定
　　用L.plantarum70810的β-半乳糖苷酶作為催化劑，分別以乳糖和纖維二糖、蜜二糖、麥芽糖、海藻糖等常見二糖為混合底物進(jìn)行酶法合成HeOS。通過活性炭-硅藻土吸附層析的方法進(jìn)行分離純化，利用GC和GC-MS監(jiān)測(cè)整個(gè)合成與純化過程，得到五種不同的HeOS純品。將純品通過NMR分析，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明，來源于L.

12、plantarum70810β-半乳糖苷酶催化混合底物反應(yīng)，專一性地以β(1→6)糖苷鍵將乳糖水解得到的半乳糖基轉(zhuǎn)移到不同糖分子受體上。五種產(chǎn)物分別為:β-D-Galp-(1→6)-β-D-Glcp-(1→4)-α，β-D-Glcpβ-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→6)-α，β-D-Glcpβ-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→1)-β-D-Glcpβ-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1

13、→4)-β-D-Glc-ol/Man-ol和β-D-Galp-(1→6)-a-D-Glcp-(1→2)-α-D-Fruf（6'-乳果糖），其中除乳果糖之外，經(jīng)Scifinder檢索，其它四種物質(zhì)前人未見報(bào)道，為合成后首次命名。
　　5.不同結(jié)構(gòu)和組成的功能性低聚糖對(duì)腸道乳酸菌體外增殖的研究
　　以L.plantarum70810的β-半乳糖苷酶作為催化劑，分別以乳糖和纖維二糖、乳糖和蜜二糖、乳糖和海藻糖、乳糖和麥芽糖醇、乳糖

14、和蔗糖為混合底物酶法制備了不同結(jié)構(gòu)和組成的GOS和HeOS，分離純化去除了混合物中的非功能性組分，并采用GC對(duì)各組分進(jìn)行了定量。然后將這些GOS和HeOS分別作為唯一碳源，以商品化Lactose和GOSQHT作為參照，對(duì)不同來源的10株LAB進(jìn)行純培養(yǎng)并繪制其生長曲線。通過考察最大生長密度(OD600)、最大比生長速率（μmax）和延滯期(lag)等指標(biāo)，研究這些不同結(jié)構(gòu)和組成低聚糖體外增殖LAB的作用效果。結(jié)果表明，由于不同LAB的生

15、長繁殖存在個(gè)體差異，不同GOS和HeOS對(duì)不同LAB表現(xiàn)出了不同的增殖效果。但綜合上述幾項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)可以發(fā)現(xiàn)，與商品化的GOSQHT比較，除對(duì)W.hellenicaLe3-1和L.brevisM3-11的增殖作用相當(dāng)，HeOS-1、HeOS-2、HeOS-3和HeOS-5對(duì)其他LAB的益生功效突出，最大生長密度和最大比生長速率均優(yōu)于GOSQHT，且生長延滯期也相對(duì)較短;而以HeOS-4作為碳源，不同LAB均表現(xiàn)出較低的生長密度和生長速率