短雙歧桿菌α-半乳糖苷酶基因及其重組表達研究.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文短雙歧桿菌α半乳糖苷酶基因及其重組表達研究姓名：陸宇申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：肖敏20040515山東大學(xué)碩士學(xué)位論文短雙歧桿菌廿半乳糖苷酶基因及其重組表達研究可能也影響到其多聚體的性質(zhì)。其次，進行了大腸桿菌中Bbreve203小半乳糖苷酶(agal)的溫度誘導(dǎo)高效表達研究。利用PCR技術(shù)，將小半乳糖苷酶基因(agal)克隆連接至溫度高效表達質(zhì)粒pBV220的EcoRI和BamHI位點，命名為pBVa

2、gal。將重組質(zhì)粒pBVagal分別轉(zhuǎn)化EcoliDH5a、BL21、DHl0B中，葉半乳糖苷酶基因(agal)在這三株宿主菌中均可進行非融合性表達，比活分別為2808unitS，mg、1385units／mg、1944units／rag，均高于Bbreve203(176units／rag)。重組質(zhì)粒pBVagal在EcoliBL2l中穩(wěn)定性較好，在無選擇壓力下，連續(xù)培養(yǎng)48h，可保持在80％，而在DH5a、DHl0B中的穩(wěn)定性較差。該

3、重組酶經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、DEAESepharoseFastFlow柱層析、GigapiteK100S柱層析和AITliconultraPL10濃縮并除鹽，酶蛋白在垂直板sDS書AGE中為一條帶，證明已得到重組的小半乳糖苷酶(Agal)電泳純，亞基分子量大小仍為67KDa，該酶在NativegradientPAGE和活性染色中仍未能顯示出均一的帶型。純酶的比活為9697units／rag，純化倍數(shù)為7倍，得率為13％。通過DNASIS分

4、析得到酶的等電點口I為519。最適反應(yīng)溫度為45℃，在40℃以下穩(wěn)定，70℃時失去所有的酶活性：最適反應(yīng)pH為4o～44，在pH36～60范圍內(nèi)穩(wěn)定。Hg、cu2、Ag強烈抑制酶的活性，而co外、M礦、Ca2、lVIAtl2、Zn2、EDTA和DTT對酶活性沒有抑制。重組酶水解酶對p硝基苯酚—旺D半乳糖苷的K。=143raM，V。。x=357llmaol／(Lrain)。通過薄層層析并未發(fā)現(xiàn)該酶有轉(zhuǎn)糖基活性。結(jié)果說明重組酶pH穩(wěn)定性、最

5、適反應(yīng)pH、溫度穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度等與我們發(fā)表的最breve203中的一種亞基分子量為78kDa的aD半乳糖苷酶(Aga2)有很大的差異，由此可以說明本實驗研究得到的小m半乳糖苷酶(Agal)是最breve203中的一種新酶，該酶有可能在丑breve203中是我們已經(jīng)研究并發(fā)表的小m半乳糖苷酶(Aga2)的一種同工酶。最后，迸行了短雙歧桿菌Bbreve203中a一半乳糖苷酶基因aga2克隆的初步研究。為了克隆Bbreve203中的小半

6、乳糖苷酶基因(aga2)，利用GenBank中檢索到不同菌株的a半乳糖苷酶基因的DNA序列，分析同源性從而設(shè)計簡并引物對旺半乳糖苷酶基因保守區(qū)進行克隆，得到大小約500bp的保守區(qū)DNA片段，進行序列的測序與比對，結(jié)果顯示克隆出的洳半乳糖菅酶基因保守序列區(qū)與已報道的2株雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis和Bifidobacteriumlongum)的葉半乳糖苷酶基因均有較高的同源性，說明此保守區(qū)DNA片段確