腐敗希瓦氏菌卵黃抗體抑菌作用方式的研究.pdf

1、卵黃抗體（IgY），是禽類(lèi)血清中的IgG進(jìn)入到卵黃中而形成的一類(lèi)免疫球蛋白，其性質(zhì)穩(wěn)定、提取便捷、特異性強(qiáng)、安全高效，作為功能性食品添加劑、食品免疫檢測(cè)材料及生物保鮮劑，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大。腐敗希瓦氏菌卵黃抗體（IgY），是一種靶向性抑制水產(chǎn)品中常見(jiàn)腐敗菌——腐敗希瓦氏菌的免疫球蛋白，目前研究已證明，腐敗希瓦氏菌IgY在液體、固體培養(yǎng)基中均能抑制腐敗希瓦氏菌體的生長(zhǎng)，并能較顯著延長(zhǎng)牙鲆魚(yú)肉的貨架期。目前，由于腐敗希瓦氏菌IgY

2、的抑菌作用機(jī)理尚不明確，在IgY的實(shí)際推廣中，存在使用濃度大，作用時(shí)間有限等問(wèn)題，使這種特異性IgY在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用受到了一定的限制，同時(shí)在尋求其抑菌增效因子時(shí)也存在盲目性。
　　本研究，主要以純度較高的腐敗希瓦氏菌IgY作為研究對(duì)象，研究它對(duì)抗原菌生長(zhǎng)形態(tài)以及各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響，以探究腐敗希瓦氏菌IgY對(duì)抑制菌體生長(zhǎng)的作用方式，同時(shí)對(duì)IgY與菌體的作用位點(diǎn)進(jìn)行了判定。隨后，研究在抑菌作用方式的基礎(chǔ)上，通過(guò)蛋白酶酶解的方法對(duì)大

3、分子的IgY進(jìn)行處理，有針對(duì)性的尋求一種提高IgY抑菌作用效果的方法。主要的研究結(jié)果如下：
　　1.利用凝膠層析的方法，建立了一套有效純化腐敗希瓦氏菌IgY的層析方法，回收率為89.60％，純化后的IgY純度達(dá)到92.33%，效價(jià)為1:1000以上，相比未經(jīng)純化的IgY效價(jià)提高兩倍以上。
　　2.對(duì)腐敗希瓦氏菌IgY對(duì)菌體的生長(zhǎng)形態(tài)、生理指標(biāo)進(jìn)行了觀察和測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)IgY作用后，菌體細(xì)胞發(fā)生破裂、扭曲，有些細(xì)菌細(xì)胞壁明顯

4、變薄。細(xì)菌疏水性下降，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均發(fā)生破裂。菌體與IgY相互作用后的上清溶液，經(jīng)甘氨酸解離作用后，發(fā)現(xiàn)了一種大分子的特征組分。通過(guò)對(duì)該特征組分分子量、單糖組成、紅外光譜性質(zhì)以及脂肪酸成分的測(cè)定，并結(jié)合核磁信號(hào)確定了其大小為58.3萬(wàn)道爾頓，主要由D-(+)-氨基葡萄糖、D-(+)-氨基半乳糖鹽酸鹽、葡萄糖、D-半乳糖以及古洛糖醛酸構(gòu)成多糖組分，并含有一定量的十二烷酸、十四烷酸和十六烷酸，推測(cè)為菌體表面脂多糖成分。經(jīng)過(guò)綜合分析，提出I

5、gY抑制腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)的方式主要是通過(guò)靶向性與菌體表面脂多糖物質(zhì)發(fā)生類(lèi)似抗原抗體結(jié)合的作用，然后通過(guò)靜電等作用，改變菌體疏水性，阻礙脂多糖發(fā)揮保護(hù)作用，從而逐漸造成菌體細(xì)胞壁松散和細(xì)胞膜的破裂，進(jìn)而造成了菌體的死亡。
　　3.在抑菌作用方式的基礎(chǔ)上，提出保留IgY抗原結(jié)合部位，同時(shí)適當(dāng)降低IgY分子量的方法以提高IgY抑菌作用效果。利用高效液相色譜法動(dòng)態(tài)觀測(cè)胃蛋白酶對(duì)腐敗希瓦氏菌IgY的作用，確定了胃蛋白酶法制備IgY-Fab的

6、最佳條件為pH=4.2的醋酸緩沖液作用6h，IgY：胃蛋白酶=20:1（質(zhì)量比）。酶解混合液經(jīng)Sephacryl S-100 High Resolution柱層析分離純化后，即得43kD的活性片段，純度大于90%。該活性片段保留了大部分的抗原結(jié)合和抑菌能力，在對(duì)冷藏大菱鲆魚(yú)肉的保鮮效果中顯示了優(yōu)于等摩爾濃度IgY的效果。
　　本研究填補(bǔ)了目前卵黃抗體對(duì)腐敗希瓦氏菌作用方式的研究空白，有針對(duì)性的提出提高IgY抑菌效果的方案，為今后腐