豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆構(gòu)建及抗體檢測ELISA方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)屬于圓環(huán)病毒科，能夠引起包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸系統(tǒng)綜合征(PRDC)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫(CT)等多種疾病在內(nèi)的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD）。此外，PCV2感染能夠引起機(jī)體免疫抑制，容易誘發(fā)多種細(xì)菌及病毒的混合感染與繼發(fā)感染。PCV2感染嚴(yán)重影響了世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　商品化疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的保護(hù)性抗體，但是P

2、CV2仍然在免疫豬群中循環(huán)傳播，而且PCV2的基因組也在不斷變異，因此人們懷疑現(xiàn)有商品化疫苗不能夠?qū)CV2提供完全保護(hù)。隨著我國、美國、韓國等國家陸續(xù)出現(xiàn)PCV2的變異毒株及疫苗免疫失敗的案例，PCV2新型高效疫苗的研制及特異性檢測方法的建立顯得尤為重要。為此，本研究主要從以下兩個方面展開:
　　1.豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆的構(gòu)建
　　通過基因克隆技術(shù)在PCV2ORF1的終止密碼子(TGA)前引入HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)

3、(AAGCTT)，將獲得的PCV2WH株基因組自環(huán)化后轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，盲傳5代。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和全基因組測序發(fā)現(xiàn)，通過感染性克隆技術(shù)拯救已獲得具有分子標(biāo)記的克隆毒株H-PCV2，可通過PCR限制性片段長度多態(tài)性分析與親本毒株相區(qū)別。通過對拯救毒株H-PCV2的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，雖然插入的HindⅢ酶切位點(diǎn)在病毒復(fù)制早期減緩了病毒的增殖，但拯救毒株與親本毒株的增殖規(guī)律類似，且第15代病毒的效價(jià)能夠達(dá)到104.8TCID50/mL。

4、通過對不同代次的H-PCV2全基因組測序發(fā)現(xiàn)嵌入的分子標(biāo)記具有較高的穩(wěn)定性，為將來區(qū)分疫苗毒株與野毒株奠定了基礎(chǔ)。
　　2.豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測ELISA方法的建立
　　為探索PCV2基因組中新的診斷抗原表位，通過生物信息學(xué)分析PCV2基因組中除ORF2外可能存在的特異性抗原片段，隨后合成7條短肽。將合成短肽通過間接ELISA和Dot-ELISA方法鑒定其與PCV2陽性血清的反應(yīng)原性，僅發(fā)現(xiàn)多肽ORF9p具有反應(yīng)原性。進(jìn)一

5、步將ORF9p作為包被抗原，建立檢測PCV2抗體的間接ELISA方法(ORF9p-ELISA)。將ORF9p-ELISA與商品化的PCV2抗體檢測試劑盒比較分析發(fā)現(xiàn)，新建立的間接ELISA方法的相對敏感性和特異性分別為84.5％和92.9％，兩種檢測方法的符合率為86.7％。隨后，利用新建立的ORF9p-ELISA方法分別檢測PCV2感染組、滅活疫苗免疫組及對照組鼠血清，發(fā)現(xiàn)PCV2感染或滅活疫苗免疫都能夠刺激小鼠產(chǎn)生針對PCV2的特異