副溶血弧菌感染斑馬魚(yú)的致病性及天然免疫應(yīng)答研究.pdf

1、近年來(lái)隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,水產(chǎn)動(dòng)物病害問(wèn)題也日益突出,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是引起多種海水魚(yú)類產(chǎn)生弧菌病的主要病原菌之一。由于水產(chǎn)動(dòng)物重大病害頻頻發(fā)生給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成災(zāi)難性的危害,使得免疫防治技術(shù)在魚(yú)病防治中呈現(xiàn)出日益廣闊的應(yīng)用前景。因此,對(duì)魚(yú)類免疫機(jī)制的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,且尤為重視天然免疫應(yīng)答機(jī)制的研究。斑馬魚(yú)(Danio rerio)擁有完整的免疫系統(tǒng)(特異和天然免疫系統(tǒng)),

2、而且體型小,生命周期相對(duì)較短,易于實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖,便于開(kāi)展大規(guī)模的試驗(yàn)。斑馬魚(yú)是研究魚(yú)類傳染病的發(fā)病機(jī)理和免疫應(yīng)答等基礎(chǔ)研究的最合適的模型動(dòng)物。
　　本研究用副溶血弧菌的魚(yú)類致病株(Vp1.2164)和人類致病株(Vp17)為研究對(duì)象,以斑馬魚(yú)為感染動(dòng)物模型,探討參與天然免疫應(yīng)答的炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律。首先,系統(tǒng)比較了不同保藏方法對(duì)副溶血弧菌的毒力及生物學(xué)特性的保藏效果,為進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)研究提供了先決條件;其次,摸索其感染斑馬魚(yú)的有

3、效方式及其致病性,分析了不同感染方式下致病菌株對(duì)斑馬魚(yú)的致病性;最后,采用熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)了斑馬魚(yú)在創(chuàng)傷感染和腹腔注射副溶血弧菌后,比較了2株副溶血弧菌創(chuàng)傷感染和腹腔注射感染斑馬魚(yú)后,IL-1β、IFN和TNF這3種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化,得到以下主要結(jié)論:
　　1、本研究發(fā)現(xiàn)不同保藏方法,副溶血弧菌隨保藏時(shí)間的延長(zhǎng)毒力有不同程度的下降。短期保藏,室溫斜面保藏比4℃斜面保藏效果好;長(zhǎng)期保藏,-80℃甘油保藏和冷凍真空干燥保

4、藏效果較好,均為24個(gè)月以上;在-20℃,保護(hù)劑脫脂牛奶比甘油的效果要好,而在-80℃甘油保藏效果很好,說(shuō)明甘油在超低溫下作為保護(hù)劑更適合副溶血弧菌。
　　2、本研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)類致病株(Vp1.2164)與人類致病株(Vp17)對(duì)野生斑馬魚(yú)的毒力差異不顯著,兩者均出現(xiàn)典型的敗血癥癥狀,可在死亡魚(yú)的體內(nèi)再分離到副溶血弧菌。組織病理切片顯示腸粘膜上皮細(xì)胞脫落、炎性水腫,脾臟充血,水腫。斑馬魚(yú)在肌肉注射、腹腔注射感染或者創(chuàng)傷皮膚后浸泡下易感

5、染副溶血弧菌,單純的浸泡不會(huì)被感染。相比而言,腹腔注射較易操作,是較優(yōu)的感染途徑。
　　3、本研究用魚(yú)類致病株(Vp1.2164)與人類致病株(Vp17)分別創(chuàng)傷感染和腹腔注射感染斑馬魚(yú),利用熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè) IL-1β、IFN和TNF三種炎性細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果表明:與對(duì)照相比,2株細(xì)菌不同感染條件下斑馬魚(yú)3種基因的表達(dá)量隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化特點(diǎn)。創(chuàng)傷感染 Vp1.2164和Vp17

6、的斑馬魚(yú)在8 h,IL-1β表達(dá)水平達(dá)到高峰,分別為對(duì)照組的125.7和100.9倍;TNF的表達(dá)水平也在8 h達(dá)到高峰,分別為對(duì)照組的249和55倍;而 IFN的表達(dá)量達(dá)最大值的時(shí)間在2株菌中出現(xiàn)差異,創(chuàng)傷感染Vp1.2164的斑馬魚(yú)在8 h,約為對(duì)照組的11.6倍,而感染 Vp17的斑馬魚(yú)在4小時(shí),為對(duì)照組的10.4倍。腹腔注射感染 Vp1.2164和Vp17斑馬魚(yú)的IL-1β表達(dá)水平在4 h達(dá)到高峰,分別為對(duì)照組的56.5和48.

7、8倍;IFN表達(dá)水平也在4 h達(dá)到高峰,分別為對(duì)照組的11和2倍;而 TNF的表達(dá)量達(dá)最大值的時(shí)間在2株菌中出現(xiàn)差異,腹腔注射感染 Vp1.2164的斑馬魚(yú)在4 h,約為對(duì)照組的143倍,而感染 Vp17的斑馬魚(yú)在2小時(shí),為對(duì)照組的46.2倍。結(jié)果顯示斑馬魚(yú)在感染后發(fā)生急性炎癥反應(yīng),且創(chuàng)傷后浸泡副溶血弧菌感染反應(yīng)比腹腔注射慢,但8 h后感染魚(yú)發(fā)生了非常強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),3種炎癥相關(guān)因子表達(dá)水平比腹腔注射感染的魚(yú)高。
　　綜上所述,我