基于LAMP法分離貝類中致病性副溶血性弧菌及其生長模型的建立.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種廣泛分布在近海沿岸海水、底泥以及各類海產(chǎn)品中的革蘭氏陰性桿狀菌，也是我國目前首要的食源性致病菌。食用被該菌污染的海產(chǎn)品會(huì)導(dǎo)致惡心、嘔吐等急性腸胃炎癥狀，尤其是生食或半生食的貝類產(chǎn)品如牡蠣等，極易引發(fā)副溶血性弧菌中毒事件。從1992-2013年我國副溶血性弧菌的污染數(shù)據(jù)表明，我國沿海主要城市海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢出率均在30％以上，檢出率最高可達(dá)到80%，尤其在夏秋兩季

2、和貝類海產(chǎn)品中有相對(duì)較高的檢出率。然而，由于副溶血性弧菌分為致病性（攜帶毒力基因）和非致病性兩種，絕大多數(shù)都是非致病的。這些污染調(diào)查數(shù)據(jù)均未對(duì)副溶血性弧菌的毒力基因開展進(jìn)一步的分析和研究，所檢樣品包含非致病性副溶血性弧菌。因此，很難通過這些檢出率的高低來確定其真實(shí)的危害程度。為了進(jìn)一步分析和研究海產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌的污染情況，以便更加真實(shí)地掌握其風(fēng)險(xiǎn)程度。本研究采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）檢測貝類產(chǎn)品中的致病性副溶血性弧菌，并

3、對(duì)分離得到的副溶血性弧菌建立合適的生長模型，目的是降低該菌引起的食源性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下：
　　1. LAMP法檢測上海市售貝類產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌
　　基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)上海市8-10月市售貝類產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌（tdh和trh毒力基因）進(jìn)行檢測分析，共檢測貝類樣品180份，6個(gè)常規(guī)品種，同時(shí)采用PCR測定方法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，含tdh和trh毒力基因的副溶血性弧菌在市售貝類中的檢出率分別是1

4、2.77%和11.66%，PCR的分析結(jié)果為11.11%和7.78%。對(duì)分離的5株致病性副溶血性弧菌進(jìn)行血清型分型后發(fā)現(xiàn)了2株O3:K6型副溶血性弧菌，其中一株為毒力基因雙陽性菌（tdh+/trh+）,PFGE分析表明這2株菌的基因條帶存在一定差異。這些結(jié)果表明上海市售貝類產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌存在一定的污染，應(yīng)引起足夠重視。PCR檢測結(jié)果對(duì)比分析表明，LAMP方法適用于貝類產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌的檢測分析。
　　2.副溶血性

5、弧菌在牡蠣中的生長模型構(gòu)建
　　采用 LAMP檢測實(shí)驗(yàn)中分離的副溶血性弧菌致病性菌株、非致病性菌株和致病性副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株于35℃、25℃、15℃和5℃下在堿性蛋白胨水、牡蠣肉和活牡蠣中繪制生長動(dòng)力曲線，并利用Excel和CurveExpert1.4軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，分別采用Richards模型、MMF模、Gompertz模型和Logistic模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立致病性副溶血性弧菌在貝類產(chǎn)品中的最佳生長模型并對(duì)其模型

6、進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　?。?）在3%Nacl堿性蛋白胨水中副溶血性弧菌非致病性菌株在35℃、25℃和15℃時(shí)較致病性菌株有更高的生長速率，在5℃時(shí)有最低的消減速率，說明副溶血性弧菌非致病性菌株比致病性菌株更適應(yīng)液體基質(zhì)中的生長環(huán)境。
　　在牡蠣肉和活牡蠣中，在35℃、25℃和15℃時(shí)樣品分離菌株較實(shí)驗(yàn)室致病性副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株有更高的生長速率，15℃時(shí)樣品分離菌株中的致病性副溶血性弧菌具有最高菌濃度值，5℃時(shí)具有最低

7、的消減速率，說明致病性副溶血性弧菌比非致病性副溶血性弧菌更適應(yīng)在貝肉和活體貝類中的生長。
　?。?）在適用模型構(gòu)建中，MMF模型在水體基質(zhì)35℃、25℃和15℃時(shí)的擬合效果最好，在貝肉基質(zhì)25℃和活體貝類15℃中的擬合效果最好。Richards模型在貝肉基質(zhì)35℃和活體貝類35℃、25℃中具有最好的擬合效果。Logistic模型適用于5℃水體基質(zhì)、貝肉基質(zhì)和活體貝類，也是貝肉基質(zhì)15℃時(shí)的最佳生長模型。對(duì)活體貝類中所建立的溫度模型