鈣霉素合成基因(calD)的功能研究及相關(guān)蛋白復(fù)合物的初探.pdf

1、鈣霉素（Calcimycin）是一類含有吡咯環(huán)的聚醚類抗生素，廣泛用于細(xì)胞二價(jià)陽離子的生物學(xué)功能研究?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)包括三部分：吡咯環(huán)、螺旋環(huán)及含有取代基團(tuán)的苯丙噁唑環(huán)。分子內(nèi)部并列排列著許多氧原子而帶負(fù)電，外部由疏水烴類構(gòu)成，因此鈣霉素作為一種二價(jià)陽離子載體嵌入膜內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞膜內(nèi)外鈉鉀等離子的運(yùn)輸并且可以特異螯合二價(jià)金屬陽離子（Ca2+、Mg2+），被廣泛應(yīng)用于二價(jià)陽離子穿膜時(shí)生物屬性的研究，另外，鈣霉素還具有抗真菌、抗部分革蘭氏陽性菌、誘導(dǎo)

2、細(xì)胞凋亡等生物活性，同時(shí)它可以抑制ATPase活性從而抑制ATP的水解，同時(shí)還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞氧化磷酸化的一種解偶聯(lián)劑。因此鈣霉素在生物基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究領(lǐng)域具有重要價(jià)值。自鈣霉素發(fā)現(xiàn)以來，已有16,000多篇文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行報(bào)道。
　　Streptomyces chartreusis NRRL3882為鈣霉素產(chǎn)生菌。前期用同位素標(biāo)記的脯氨酸、乙酸、甲酸、3-羥基鄰氨基苯甲酸和甲硫氨酸進(jìn)行喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn),揭示了鈣霉素骨架結(jié)構(gòu)的生物合成前體來源

3、。鈣霉素的生物合成基因簇于2011年被成功克隆。鈣霉素的整個(gè)生物合成途徑已經(jīng)成功得到推導(dǎo)，部分基因功能已得到確定。
　　為確認(rèn)功能未知基因calD，預(yù)將基因calD克隆到鈣霉素產(chǎn)生自身菌教酒鏈霉菌NRRL3882中，同時(shí)引入Flag標(biāo)簽以便下游的蛋白純化。HPLC檢測(cè)分析回補(bǔ)菌株、野生菌株和突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，回補(bǔ)菌株恢復(fù)了鈣霉素產(chǎn)生能力，確定calD基因回補(bǔ)成功，同時(shí)說明Flag標(biāo)簽的引入不會(huì)影響教酒鏈霉菌中鈣霉素的合成。從鈣霉

4、素表達(dá)量、菌體量和菌體破碎難易程度三個(gè)方面在發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間兩個(gè)參數(shù)上進(jìn)行條件優(yōu)化，以期提高目的蛋白得率。最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為YEME培養(yǎng)基，最佳發(fā)酵時(shí)間為10天，并進(jìn)行后續(xù)的大規(guī)模發(fā)酵工作。Western blotting實(shí)驗(yàn)確認(rèn)Flag標(biāo)簽融合蛋白CalD-Cflag在鏈霉菌中的成功表達(dá)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CalD蛋白屬于氧化還原酶超家族，HPLC結(jié)果顯現(xiàn)calD基因的缺失導(dǎo)致突變株鈣霉素產(chǎn)生能力大大低于野生菌株，高分辨質(zhì)譜和二

5、級(jí)質(zhì)譜結(jié)果顯示突變株中積累了多于野生菌株的3-Hydroxylcezomycin，因此calD基因的缺失阻斷了3-Hydroxylcezomycin的大部分轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致突變株內(nèi)3-Hydroxylcezomycin的積累。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CalD蛋白屬于氧化還原酶家族，因此推測(cè)CalD蛋白酶可能負(fù)責(zé)催化苯丙噁唑環(huán)上3’羥基的氧化，氧化產(chǎn)物可能為酮基化合物，即3-Ketocezomycin。
　　從鈣霉素基因簇上克隆到聚酮合酶（PKS）

6、基因：calA1、calA2、calA3、calA4、calA5，構(gòu)建了九種重組病毒：AcNPV-CalA1，AcNPV-CalA2,AcNPV-CalA3,AcNPV-CalA4,AcNPV-C5,AcNPV-CalA1 His,AcNPV-CalA2StrepII,AcNPV-CalA3StrepIII，AcNPV-CalA4Flag。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白，親和層析嘗試小體積蛋白純化，并得到部分聚酮合酶蛋白，證明了昆蟲細(xì)胞-桿狀