利用磁性納米粒子檢測蛋清中抗生物素蛋白的方法研究.pdf

1、抗生物素蛋白(Avidin)是雞蛋蛋清中的一種天然存在的糖蛋白,因為其具有抗菌抗蟲活性而得到廣泛應用。隨著Avidin的發(fā)展,需要靈敏度更高、操作更簡便的蛋白檢測方法。本文在制備磁性納米粒子的基礎上,分別建立了競爭法和夾心法檢測蛋清中的Avidin,并且將這兩種方法與熒光分光光度法比較。研究結果如下:
　　 采用溶劑熱法制備Fe3O4磁性納米粒子(MNPs),單因素實驗得到最佳制備工藝條件為:0.2702 g FeCl3·6H2

2、O和2.70 g NaAC混合溶解于20 mL乙二醇中,磁力攪拌30 min后加入0.50 g聚乙烯亞胺,磁力攪拌30 min得到均勻粘稠的反應前驅物。量取20 mL反應前驅物到反應釜中,200℃下反應時間12 h,自然冷卻后取出用水和無水乙醇洗滌,真空干燥得到Fe3O4納米粒子。
　　 上述最適工藝條件制備的Fe3O4納米粒子通過紅外圖譜分析證明表面含有大量氨基,并且利用對硝基苯甲醛法測得表面氨基含量為14.97 nmol/m

3、g,利用振動樣品磁強計測得其飽和磁化強度為64.93 emu/g。根據TEM觀察結果可知納米粒子粒徑為30 nm,分散性較好。
　　 將磁性納米粒子與抗體偶聯(lián),討論得到最佳偶聯(lián)條件為:納米粒子先用15％的戊二醛活化,活化后的納米粒子在pH7.4的0.05 M PBS中與抗體偶聯(lián),當抗體磁性粒子的質量比(μg:mg)為300:1時,抗體的連接效率最高,可以達到約50μg/mg。
　　 建立了基于磁性納米粒子的測定Avidi

4、n的競爭結合法。并對實驗條件進行優(yōu)化,確定最適合Biotin-MNPs濃度為400μg/mL,HRP-Avidin稀釋度為1:2000,并在測定此條件下Avidin的抑制曲線,由抑制曲線得到標準曲線,得到回歸方程:y=-1.4193x+3.9729,相關系數R2=0.9838。該方法的最低檢測限為79.4 ng/mL,檢測范圍為79.4-5000.0 ng/mL,批內變異系數為7.22％,批間變異系數為9.17％。與溶菌酶、BSA、卵白

5、蛋白和卵轉鐵蛋白交叉反應率均小于0.2％。該方法的回收率在95％-122％之間。
　　 建立了基于磁性納米粒子的測定Avidin夾心法。并對實驗條件進行優(yōu)化,確定免疫磁珠最適濃度為600μg/mL,HRP-Biotin最適稀釋度為1:800,底物顯色條件為室溫下避光反應10 min,并在測定此條件下檢測Avidin的標準曲線,以OD490為縱坐標,Avidin濃度的對數為橫坐標,y=0.2725 x-0.7036,相關系數R2=

6、0.9915。該方法的最低檢測限為30ng/mL,線性范圍為31.2-10000.0 ng/mL,批內變異系數為3.49％,批間變異系數為4.40％。溶菌酶、BSA、卵白蛋白和卵轉鐵蛋白對應的OD490與相同濃度Avidin孔的OD490有明顯差異,該方法的回收率在88.2％-99.4％之間。
　　 用三種方法測定的三個不同品種雞蛋中的Avidin濃度都在42-60μg/mL左右。對熒光分光光度法和競爭法的檢測結果進行相關性和配