基于納米粒子、酶的信號(hào)放大生物分析方法研究.pdf

1、發(fā)展靈敏度較高的免疫分析技術(shù)一直以來(lái)是免疫分析領(lǐng)域研究的一個(gè)重要方面，它對(duì)于實(shí)現(xiàn)一些重要疾病標(biāo)志物的檢測(cè)有著至關(guān)重要的意義。電化學(xué)儀器具有簡(jiǎn)便、靈敏、易于微型化等優(yōu)點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)新的電化學(xué)信號(hào)放大免疫分析技術(shù)無(wú)疑可以推動(dòng)免疫分析的發(fā)展。此外，人類的許多遺傳性疾病都是由于基因的變異引起的，其中尤以單堿基的突變，即單堿基多態(tài)性最為普遍。實(shí)現(xiàn)對(duì)這些基因單堿基突變的早期、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的確認(rèn)，對(duì)于人類相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理研究及早期治療具有非常重

2、要的意義。目前，有關(guān)單堿基突變的檢測(cè)方法已有許多報(bào)道。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費(fèi)時(shí)、不易定量、儀器昂貴、且對(duì)工作人員要求較高的專業(yè)技能，因此僅能在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。開(kāi)發(fā)一些簡(jiǎn)便、價(jià)廉、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價(jià)值的工作。為此，本文主要在高靈敏度的電化學(xué)免疫分析方法方面以及電化學(xué)DNA檢測(cè)技術(shù)方面做了一些工作： 1．提出了一種基于循環(huán)富集納米金的新型電化學(xué)免疫分析方法。脫硫生物素與親合素的結(jié)合常數(shù)比較小，當(dāng)其與親合素結(jié)

3、合后，在生理?xiàng)l件下即可被生物素取代，利用此取代反應(yīng)可對(duì)納米金進(jìn)行循環(huán)富集，從而實(shí)現(xiàn)提高免疫分析靈敏度的目的。免疫分析采用夾心法。先將羊抗人IgG包被在酶標(biāo)孔里，經(jīng)牛血清蛋白(BSA)封閉后再加入分析物人IgG，接著加入標(biāo)記有脫硫生物素的羊抗人IgG形成夾心復(fù)合物。然后加入金標(biāo)親合素溶液進(jìn)行溫育反應(yīng)，最后加入生物素溶液通過(guò)取代反應(yīng)實(shí)現(xiàn)金標(biāo)親合素的洗脫。由于脫硫生物素標(biāo)記的抗體在取代反應(yīng)后仍保持相當(dāng)高的生物活性，故可再加入新鮮的金標(biāo)親合素與

4、上一步保存的生物素溶液進(jìn)行循環(huán)洗脫，最后通過(guò)溶出伏安法(ASV)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)金的陽(yáng)極溶出峰電流隨循環(huán)富集次數(shù)的增加而逐漸增加，當(dāng)達(dá)到八次后信號(hào)趨于穩(wěn)定。為了縮短免疫分析時(shí)間，采用5次循環(huán)富集，也可保證較高的靈敏度，檢測(cè)限達(dá)0.75ng/ml。在空白實(shí)驗(yàn)中，即使循環(huán)富集10次，其背景信號(hào)仍是相當(dāng)?shù)牡汀？赡艿迷蚴欠翘禺愋晕降慕饦?biāo)記物難以在生理?xiàng)l件下被洗脫，因此大大降低了背景信號(hào)，因此如果提高循環(huán)洗脫的次數(shù)可以檢測(cè)到0.1 ng/m

5、l人IgG。在同樣的條件下8次檢測(cè)1 ng/ml人IgG，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.57％。 2．提出了一種基于磁性納米粒子放大金標(biāo)伏安免疫分析技術(shù)。修飾有生物素的磁性納米粒子能夠結(jié)合多個(gè)金標(biāo)親和素，形成磁性納米粒子-納米金復(fù)合物。利用脫硫生物素修飾抗體，夾心免疫反應(yīng)后可與磁性納米粒子．納米金復(fù)合物特異性結(jié)合。通過(guò)生物素取代可洗脫復(fù)合物，結(jié)合溶出伏安分析可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的線性放大。通過(guò)生物素的競(jìng)爭(zhēng)洗脫，可以有效地降低非特異性吸附引起的背景信號(hào)

6、，從而為低濃度抗原的檢測(cè)提供了可能。我們采用了溶出伏安法檢測(cè)，檢測(cè)下限為0.1ng/mL。 3．提出了一種基于循環(huán)富集辣根過(guò)氧化物酶的用于檢測(cè)人IgG的新型熒光免疫分析方法。脫硫生物素與親合素的結(jié)合常數(shù)比較小，當(dāng)其與親合素結(jié)合后，在生理?xiàng)l件下即可被生物素取代，利用此取代反應(yīng)可對(duì)辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行循環(huán)富集。當(dāng)用緩沖液代替抗原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)即使循環(huán)富集步驟達(dá)到七次其產(chǎn)生的背景信號(hào)也相當(dāng)?shù)?，這種特性使得本方法能夠檢測(cè)到0.05 ng/ml的

7、人IgG。 4．提出了一種基于銅增強(qiáng)的金標(biāo)伏安免疫分析方法。在這種方法中，抗體首先通過(guò)物理方法固定到酶標(biāo)孔內(nèi)壁，夾心免疫反應(yīng)后，納米金標(biāo)記的抗體被捕獲到生物界面。再加入銅增強(qiáng)試劑，由于納米金的晶核催化效應(yīng)，在還原劑存在的條件下，銅離子在納米金的表面得以還原，形成厚厚的銅殼。然后通過(guò)化學(xué)法將銅溶解后用溶出伏安法檢測(cè)溶出的銅離子。檢測(cè)下限為0.5 ng/ml。將本方法應(yīng)用于實(shí)際血樣的分析，取得了滿意的結(jié)果。據(jù)我們所知，這是首例將銅增

8、強(qiáng)引入到免疫分析中來(lái)的報(bào)道。 5．在前面工作的基礎(chǔ)上我們提出了一種基于銅增強(qiáng)新型電化學(xué)免疫傳感器的制備方法。在這種方法中，抗體首先通過(guò)化學(xué)方法修飾到玻碳電極表面，夾心免疫反應(yīng)后，納米金標(biāo)記的抗體被捕獲到電極表面。再加入銅增強(qiáng)試劑，由于納米金的晶核催化效應(yīng)，在還原劑存在的條件下，銅離子在納米金的表面得以還原，形成厚厚的銅殼。然后將傳感器轉(zhuǎn)移到電解池中施加線性掃描，就可以通過(guò)檢測(cè)銅的陽(yáng)極峰電流的大小來(lái)實(shí)現(xiàn)抗原分子的定量分析。檢測(cè)下限

9、為0.075 ng/ml。與傳統(tǒng)的金增強(qiáng)和銀增強(qiáng)比較，本文提出的銅增強(qiáng)具有一定的優(yōu)勢(shì)。如避免了溶出伏安分析的繁瑣步驟，采用的銅增強(qiáng)試劑也比較容易配制和保存，同時(shí)還保持了較高的靈敏度。 6．結(jié)合瓊脂糖免疫微球的分離特性及生物金屬化的概念提出了一種新型電化學(xué)免疫分析方法。瓊脂糖微球表面標(biāo)記有親和素分子，因此我們可以將生物素化的羊抗人IgG通過(guò)生物素親和素之間的親和反應(yīng)標(biāo)記到瓊脂糖微球表面。形成瓊脂糖免疫微球。然后將固定量的瓊脂糖免疫

10、微球，堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體以及待測(cè)抗原人IgG三者混合反應(yīng)后分離洗滌四次以保證除去未反應(yīng)的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體以及待測(cè)抗原人IgG。最后加入磷酸抗壞血酸酯和硝酸銀的混合溶液，避光反應(yīng)半小時(shí)。分離洗滌八次后用硝酸溶解銀，溶出伏安法檢測(cè)銀離子。由于反應(yīng)是在均相中進(jìn)行，因此不僅縮短了免疫分析時(shí)間，還大大提高了免疫反應(yīng)的效率。 7．提出了一種基于分子信標(biāo)和酶催化放大的電化學(xué)DNA傳感器的研制方法。我們先將5′