Zymomonas mobilis ZM4乙醇發(fā)酵副產(chǎn)物產(chǎn)生相關(guān)基因敲除菌株的構(gòu)建和評價.pdf

1、隨著全球化石能源日漸枯竭、環(huán)境污染日益嚴重,用生物燃料乙醇代替不可再生的化石能源具有越來越重要的意義。隨著淀粉質(zhì)原料、糖質(zhì)原料和木質(zhì)纖維素相繼成為燃料乙醇主要的生產(chǎn)原料,發(fā)酵用菌種仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。作為產(chǎn)醇能力最強的細菌,運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)仍然具有蔗糖原料上副產(chǎn)物多、產(chǎn)醇率低,木質(zhì)纖維素原料上可利用底物范圍窄、抗逆性差等主要缺點。
　　為鑒定乙醇發(fā)酵副產(chǎn)物乳酸和山梨醇、葡萄糖酸等產(chǎn)生相關(guān)基因,減

2、少副產(chǎn)物生成,同時考察對Z.mobilis進行拓展碳源范圍改造時外源基因整合的合適位點,本研究首先結(jié)合使用同源重組和基于釀酒酵母FLP-FRT系統(tǒng)的位點特異性重組的方法,分別構(gòu)建了Z.mobilisZM4與乳酸產(chǎn)生相關(guān)的基因ldhA、D-ldh以及與山梨醇、葡萄糖酸產(chǎn)生相關(guān)的基因gfo的缺陷型菌株ZM4(ldhA::FRT)、ZM4(D-ldh::FRT)、ZM4(gfo::FRT);其次,通過重復(fù)使用選擇標記基因cml,進一步構(gòu)建得到

3、ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)、ZM4(ldhA::FRT)(gfo::FRT)和ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)(gfo::FRT)缺陷型菌株,從而建立了穩(wěn)定的、重復(fù)性好的多重基因缺陷又無抗性選擇標記的Z.mobilis菌株構(gòu)建方法。
　　最后,以ZM4為對照,對上述缺陷型菌株進行了以副產(chǎn)物、乙醇、生長為主要指標的評價。評價結(jié)果表明:
　　1)ZM4(ldhA::FRT)、ZM4(

4、D-ldh::FRT)和ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)菌株:乳酸脫氫酶酶活分別為0.609、0.566、0.594U/mgprotein,均低于菌株ZM4(為0.835U/mgprotein);乳酸產(chǎn)量稍稍低于ZM4,而以ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)乳酸產(chǎn)量為最低,在基本培養(yǎng)基MM中所產(chǎn)生的乳酸遠比豐富培養(yǎng)基RM中所產(chǎn)乳酸要低;相應(yīng)地,ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)的乙

5、醇生產(chǎn)也是最高,2％RM培養(yǎng)基中12h的乙醇產(chǎn)率達0.945g/100g(ZM4為0.900g/100g),而單缺陷菌株ZM4(ldhA::FRT)和ZM4(D-ldh::FRT)分別為0.905、0.915g/100g;缺陷型菌株和野生型無論在RM還是MM上的生長彼此之間都沒有差距。
　　2)ZM4(gfo::FRT)菌株:缺陷型菌株和野生型分別在不同濃度的蔗糖、葡萄糖、果糖和葡萄糖/果糖混合糖為底物的培養(yǎng)基中生長發(fā)酵并對其進行

6、對比分析評價。結(jié)果表明:ZM4(gfo::FRT)在所有的培養(yǎng)基中都沒有山梨醇產(chǎn)生;在蔗糖和葡萄糖/果糖混合糖為底物的培養(yǎng)基中缺陷型菌株乙醇產(chǎn)率明顯提高,尤其在高濃度蔗糖中產(chǎn)醇效果最明顯,20%、36%蔗糖濃度下的最大乙醇得率分別為85.06%、83.87%,而ZM4分別為66.27%、60.56%;在葡萄糖為底物的培養(yǎng)基中隨著濃度的升高產(chǎn)醇有所下降,在20%的葡萄糖中乙醇產(chǎn)率只達到67.59%(而ZM4為89.85%);ZM4(gfo

7、::FRT)在果糖中的生長發(fā)酵與ZM4沒有明顯差異;缺陷型菌株的生長和產(chǎn)醇類似,在蔗糖和葡萄糖/果糖混合糖為底物的培養(yǎng)基中生長較好,36%的蔗糖中最大OD600可達8左右,而野生型只有5,20%葡萄糖中生長有一定的延遲;而加入山梨醇到培養(yǎng)基中僅輕微改善了ZM4(gfo::FRT)在36%蔗糖中的生長和發(fā)酵,卻使ZM4(gfo::FRT)在20%葡萄糖中的生長和發(fā)酵恢復(fù)到接近ZM4的水平。
　　3)ZM4(ldhA::FRT)(gf

8、o::FRT)和ZM4(ldhA::FRT)(D-ldh::FRT)(gfo::FRT)菌株:缺陷型菌株和ZM4分別在36%的蔗糖、20%的葡萄糖和20%的果糖中生長發(fā)酵,然后進行對比評價。結(jié)果表明:36%蔗糖中缺陷型菌株不產(chǎn)生山梨醇,副產(chǎn)物乳酸生成量下降,乙醇濃度明顯提高,穩(wěn)定期乙醇產(chǎn)率分別達到93.22、91.46g/L(ZM4為53.09g/L);20%葡萄糖中缺陷型菌株雖然都有一定的生長延遲,但乳酸的產(chǎn)生量仍然低于ZM4,最終的

9、乙醇產(chǎn)量還是稍高于ZM4,分別為77.35、88.33g/L(ZM4為74.23g/L);缺陷型菌株在20%果糖中的生長發(fā)酵均接近ZM4,沒有明顯效應(yīng);缺陷型菌株在36%蔗糖中的生長雖然有24h的生長延遲,但是最后OD還是高于野生型菌株,在20%葡萄糖中雙缺陷菌株延遲32h開始生長,三缺陷菌株延遲48h開始生長,但是最后三個菌株的OD相當。
　　4)四個菌株ZM4、ZM4(gfo::FRT)、ZM4(ldhA::FRT)(gfo: