D-乳酸產(chǎn)生菌株的基因敲除.pdf

1、D-乳酸是眾多手性物質(zhì)的合成前體，廣泛應(yīng)用于化工、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域。目前，國際上主要采用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，發(fā)酵原料成本較高且產(chǎn)量較低，導(dǎo)致產(chǎn)品價(jià)格較高。與乳酸菌相比較，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下能夠以相對簡單的原料為底物，達(dá)到較高的乳酸生產(chǎn)效率，發(fā)酵優(yōu)勢明顯，但目前國際上這方面的研究報(bào)道很少，本研究利用谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下的這一發(fā)酵優(yōu)勢，首次在C.glutamicum Res167中進(jìn)行了D-乳酸代謝途徑的改造，敲除

2、L-乳酸脫氫酶基因(L-lactate dehydrogenase，ldh)并完成優(yōu)勢外源D-乳酸脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建，為實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌中高效率、低成本D-乳酸的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了得到高純度的D-乳酸，需要阻斷谷氨酸棒桿菌中的L-乳酸代謝途徑。因此，本文首先對D-乳酸及L-乳酸代謝途徑進(jìn)行分析，并對L-乳酸脫氫酶基因進(jìn)行敲除研究。從C.glutamicum Res167基因組中克隆出ldh的上下游同源臂ldh1和ld

3、h2，利用重疊PCR將其拼接成ldh1-ldh2，然后連接到C.glutamicum Res167中的自殺載體pK18mobsacB上，構(gòu)建了谷氨酸棒桿菌ldh基因敲除載體pK18mobsacB△ldh。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至C.glutamicum Res167中，通過卡那霉素抗性正向篩選和蔗糖培養(yǎng)基反向篩選獲得了雙交換重組菌株C.gl utamicumRes167Δldh。進(jìn)行固體平板培養(yǎng)基生長實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，C.glutamicum Re

4、s167Δldh在以L-乳酸為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上不能生長，初步證明了L-乳酸脫氫酶基因的缺失阻斷了菌體中L-乳酸的代謝，完成了L-乳酸脫氫酶基因的敲除。
　　 為了進(jìn)一步提高谷氨酸棒桿菌中D-乳酸的生產(chǎn)效率，本工作選擇來源于保加利亞乳桿菌的D-乳酸脫氫酶(D-lactate dehydrogenase，ldhA)優(yōu)勢異源基因，構(gòu)建了含有該基因的重組載體pXJM19-ldhA。實(shí)驗(yàn)首先對對谷氨酸棒桿菌-大腸桿菌中的穿梭表達(dá)載體